眼镜蛇血清解毒蛋白的溴化氰裂解肽段与自身神经毒素的结合^△

　　中国医学科学学院学报1999年第21卷第5期

柴婴蕾　邵靖宇^#

　　摘　要　目的　为进一步认识眼镜蛇血清解毒蛋白 (CSAP) 如何与神经毒素结合并解毒。方法　用溴化氰裂解 CSAP 肽链中由 Met 羧基端组成的肽键，裂解产物经超滤除去分子量小于 10 000 的片段后，用亲和层析法得到与毒素仍保持有亲和力的肽段。结果　与毒素仍保持有亲和力的肽段相当于 Lys2-Met485，Lys2-Met275，Lys276-Met485，Pro444-Met603。结论　CSAP 的3个结构域均具有与毒素分子结合的活性，CSAP 结合的8个毒素分子分散在整个肽链的各个段落上。

　　关键词：眼镜蛇血清解毒蛋白　眼镜蛇血清白蛋白　眼镜蛇神经毒素　溴化氰肽链裂解反应　亲和层析

　　眼镜蛇血清解毒蛋白 (cobra serum antitoxic protein，CSAP) 是第一个被证实为血清白蛋白的蛇类解毒蛋白 (眼镜蛇血清白蛋白，cobra serum albumin)，也是第一个被测定氨基酸序列的蛇类解毒蛋白，它为一由 614 个氨基酸残基组成的单一多肽链，分子量 69 800^［1］。CSAP 肽链结构的基本框架与哺乳动物血清白蛋白十分相似，其 34 个半胱氨酸残基在肽链的分布及形成二硫键的模式与已知哺乳动物血清白蛋白基本相似，整个分子也可分为类似的 3 个结构域 (domain Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。以往研究观察到每分子 CSAP 约能结合 8 个毒素分子，但其与各毒素分子的结合强度有差别^［2］。CSAP 与毒素分子的结合位点既可能分散在几个结构域中，也可能集中于某个区域。本实验用溴化氰裂解 CSAP，从裂解后肽段与神经毒素分子的结合探讨其结合位点。

　　1　材料和方法

　　试剂　Sephadex G-25、G-50，Sepharose 4B (Pharmacia), CM-cellulose 23, DEAE-cellulose 32 (Whatman), CNBr, Dansyl-Cl (Sigma)。其余试剂均为分析纯。

　　材料　(1) 眼镜蛇血清：采自浙江安吉县，将眼镜蛇断头取血，室温放置 3 h，离心取血清，-20℃ 保存。(2) 眼镜蛇粗毒：采自浙江永康，冻干粉 -20℃ 保存。

　　方法　

　　眼镜蛇神经毒素 (NT) 的制备：参照 Kaneda 等^［3］ 方法，将眼镜蛇粗毒冻干粉溶于 1％ 醋酸溶液，上 Sephadex G-50 柱，用 1％ 醋酸洗脱，收集有毒性的蛋白峰冰冻干燥。将此冻干粉溶于 0.005 mol/L (pH 5.8) 醋酸钠缓冲液，上 CM-cellulose 23 柱，用起始浓度为 0.25 mol/L (pH 6.1)、终末浓度为 0.50 mol/L (pH 6.5) 的醋酸钠缓冲液直线梯度洗脱。

　　纯化 CSAP 的制备：眼镜蛇血清加等体积饱和硫酸铵溶液，4℃ 静置 4 h，离心 (3500 r/min，15 min)，取上清液上 Sephadex G-25 柱脱盐，收集蛋白峰冰冻干燥。此冻干粉上 DEAE-cellulose 32 柱，先后用吡啶浓度为 0.002 mol/L，氯化钠浓度分别为 0.04、0.06、0.08 和 0.10 mol/L 的缓冲液 (pH 4.2) 进行阶段梯度洗脱。

　　NT-Sepharose 4B 亲和层析柱的制备：参照骆爱玲等^［4］ 方法，最后用 0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.4) 缓冲液平衡备用。

　　CSAP 的溴化氰 (CNBr) 裂解：取 20 mg(0.28 μmol) 纯化的 CSAP 冻干粉溶于 0.9 ml 去离子水中，再加 5.1 ml 的 88％ 甲酸溶液 (甲酸终浓度 75％)，25℃ 裂解反应 16 h 得到肽段溶液，超滤 (截留分子量界限为 10 000)，溶于 3 ml 0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.4) 缓冲液备用。

　　与 NT 结合的 CSAP 裂解肽段的获得：将上述 CSAP 裂解后制备的肽段溶液上 NT-Sepharose 4B 亲和层析柱，平衡 30 min 后，先用起始 pH 6.5、终末 pH 4.5 的醋酸铵缓冲液 (10 mmol/L) 直线梯度洗脱，再用含 0.5 mol/L 氯化钠的 0.1 mol/L 醋酸钠 (pH 4.0) 缓冲液洗脱。

　　肽的 N-末端氨基酸 DNS 分析：按张龙翔等^［5］ 方法。

　　2　结果和讨论

　　经 CM-cellulose 23 柱分离得到神经毒素 (NT)，用醋酸纤维素薄膜电泳检测，NT 能与 CSAP 结合而形成新的区带。

　　经 DEAE-cellulose 32 柱分离得到 CSAP (醋酸纤维素薄膜电泳检测在白蛋白位置)，收集该蛋白冰冻干燥，用 PAGE 及 SDS/PAGE 鉴定其纯度，均为单一区带。该纯化的 CSAP 经 CNBr 裂解并超滤去除分子量 1万以下的肽段后，经 SDS/PAGE 检测，得到 6 个裂解肽段 (以字母 a～f 顺序表示)，分子量分别为 56 500±800、32 500±1 400、30 200±2 600、21 800±1 100、15 200±1 700 和 13 200±1 600 (附图)。

附图　SDS/PAGE 电泳检测 CSAP 的溴化氰裂解肽段

Fig　SDS/PAGE of fragments of the CSAP

　　Lane A:　fragments of the CSAP;

　　Lane B:　the marker proteins

　　The top line of lane A is uncleaverd CSAP

　　利用 NT-Sepharose 4B 亲和层析柱分离 CSAP 的裂解肽段时，用低盐浓度的缓冲液洗脱没有收集到肽段，表明这些肽段与 NT 的结合比较牢固。后用含 0.5 mol/L 氯化钠的 0.1 mol/L 醋酸钠 (pH 4.0) 缓冲液洗脱，收集到 4 个能与 NT 结合的 CSAP 裂解肽段。用 SDS/PAGE 测定其分子量，分别与 a、b、c 和 e 肽段相当。经肽 N-末端氨基酸 DNS 分析，这 4 个肽段的 N-末端氨基酸为 Pro、Gly 和 Lys。

　　综合以上结果，推测这 4 个肽段应为 Lys2-Met485，Lys2-Met275，Gly276-Met485 和 Pro444-Met603。这些肽段分别位于 CSAP 分子中的 domain Ⅰ+Ⅱ+60％ⅢA，domain Ⅰ+54％ⅡA，46％ⅡA+ⅡB+60％ⅢA 和 75％ⅢA+88％ⅢB。提示 CSAP 裂解后，其某些肽段仍能回复与神经毒素结合的构象，保持与神经毒素结合的能力。CSAP 与神经毒素结合的位点可能分散在其分子的 3 个结构域中，故每个 CSAP 分子可结合多个毒素分子而使眼镜蛇血清中游离的毒素浓度很低，从而使眼镜蛇免于遭到其自身的伤害。

　　作者单位：浙江大学医学院生物化学教研室，杭州 310031

　　参考文献

　　1　王晓路， Havsteen B， 邵靖宇. 眼镜蛇血清解毒蛋白基因的分子克隆和序列分析. 中国医学科学院学报， 1996， 18(4)：263～272

　　2　Shao JY, Shen H, Havsteen B. Purification, characterization and binding interactions of the Chinese-cobra (Naja naja atra) serum antitoxic protein CSAP. Biochem J, 1993, 293 (Pt 2): 559～566

　　3　Kaneda N, Sasaki T, Hayashi K. Primary structures of cardiotoxin analogue Ⅱ and Ⅳ from the venom of Naja naja atra. Biochim Biophys Acta, 1977, 491 (1): 53～66

　　4　骆爱玲， 黄巨富. 免疫亲和吸附剂制备方法的某些改进. 植物生理学通讯， 1991， 27 (2)：123～124

　　5　张龙翔， 张庭芳， 李令媛. 生化实验方法和技术. 第2版. 北京：高等教育出版社， 1997. 61～66