范可尼贫血分子生物学研究进展

中国实验血液学杂志 Journal of Exprerimental Hematology 1999；7(2)

谢　燕

（湖北医科大学附属第一医院血液科　武汉430060）

　　摘要　范可尼贫血（FA）是一种常染色体隐性遗传性疾病，临床表现复杂，单靠临床表现难以确认。FA细胞对交联剂（MMC和DEB）特异性敏感，FA的诊断要依靠MMC/DEB诱导的染色体断裂试验。FA分为8个互补群（A-H），可能代表不同的基因，其中FAA最多见。FAA与FAC基因已被克隆了，并分别定位于9q22.3与16q24.3,FAD定位于3p22-26。基因型与FA临床表现有关。具有IVS4和外显子14突变的FAC患者临床表现重，预后差。FAA与FAC基因产物分别为1455和558氨基酸的蛋白质，其功能不详，FAC蛋白可能参与细胞调亡。在FA患者还存在嵌合体现象，某些嵌合体患者病情轻，提示嵌合体现象可能是自然发生的基因治疗。FAC的基因治疗已进入临床阶段，近期疗效良好，远期疗效有待评价。FAA的基因治疗尚处于实验室试验阶段。

　　关键词　范可尼贫血 嵌合体 互补群基因治疗

　　中国图书资料分类法分类号　R556·5

　　范可尼贫血（Fanconi anemia，FA）是一种常染色体隐性遗传性疾病，其发病率为1-3/100万。基因携带频率为1/300^[1,2]。本病在各人种中均有发现。近亲婚配者发病机率增加。

　　典型的FA表现为造血功能衰竭，多发性先天畸形，如发育迟缓，矮小，拇指畸形，桡骨畸形，心肾畸形等。然而，FA临床表现常不典型，难以诊断。FA细胞对某些DNA交联剂即丝裂霉素(mitomycin c，MMC)/二环氧丁烷(diepoxybutane，DEB)异常敏感，在低浓度的MMC/DEB诱导下FA患者的染色体断裂率明显高于正常人。有关专家一致认为FA的诊断要依靠MMC/DEB诱导的染色体畸变试验^[1,2]。

遗传异质性与互补群

　　利用体细胞融合杂交技术和FA细胞对交联剂异常敏感的缺陷研究FA的遗传异质性，称互补分析（complementation analysis）。将来源于不同FA患者EB病毒活化的B-淋巴母细胞系融合杂交，检查子代杂交细胞的FA样缺陷，如果子代杂交细胞这一缺陷得到纠正，称为互补（complementation），则表示其父代的两株FA细胞存在不同的基因缺陷，属于不同互补群（complementation group），如果子代杂交细胞这一缺陷得不到纠正，称为不互补（noncomplentation），则表示其父代的两株FA细胞存在同一基因的缺陷，属同一互补群。Joenje＇等^[3,4]借此法进行研究，至今已发现FA至少有8个互补群（A,B,C,D,E,F,G,H）。

　　已有的资料表明，在FA者中各互补群所占的比例不同，FFA占66％，FAC占12.7％，FAB占4.3％，FAD占4.3％，FAE-FAH占12.7％。不同人群的互补群分布不同。在北欧犹太人以及荷兰人中FAC较多。在意大利人和南非的讲南非荷兰语（Afrikaans）的人群中FAA较多，而德国人中FA各互补群均有发现，且无优势互补群，至今尚无亚洲人群互补群的资料^[2,4,5]。不同互补群与患者的临床表现无明显关系。

　　FA的不同互补群可能代表不同的基因^[6]。FAA和FAC基因已被克隆了，FAD定位于染色体3p22-26的区域^[7]。

FAC及其基因

　　Strathdee等^[8]利用cDNA表达克隆法克隆了FAC基因。他们用含人淋巴母细胞cDNA文库的游离型载体pREP4转染HSC536(FA-C)细胞系，经MMC/DEB筛选出8个阳性克隆。从这8个阳性克隆中分离出的8个cDNA均有同样的开放阅读框ORF（open reading frame），而5＇UTR和3＇UTR不同。FAC cDNA约2.3kb，FAC基因定位于染色体9q22.3，长1674bp，含14个外显子，大小分别为53-204bp不等^[8,9]。

　　FAC编码一个63kD（558个氨基酸）蛋白质，其结构不同于任何已知蛋白质。FAC蛋白质主要位于细胞浆中，提示FAC不直接参与DNA修复。强制性的把FACA蛋白质导入核内反而使FAC蛋白质失去了纠正FAC细胞缺陷的功能，说明FAC位于胞浆是FAC发挥作用所必需的^[10]。超量表达L544P突变的FAC蛋白质可使正常细胞呈FA细胞特征，提示胞浆中有FAC结合蛋白，免疫沉淀FAC蛋白质也支持此观点。FAC反义寡核苷酸也可使正常的细胞呈FA样表现，提示FAC有保护细胞免受烷化剂和交联剂的损害的功能^[11,12]。

　　鉴于FAC位于胞浆，许多研究探讨其在细胞凋亡中的作用。在MMC或γ射线作用下细胞内抑癌基因产物p53聚集，持续的p53聚集导致细胞凋亡；而FAC细胞在MMC或γ射线作用下p53不能聚集，因此Rosselli等^[13]认为FAC基因通过p53依赖的途径调节细胞凋亡。然而Kruyt等^[14]持不同意见，他们的研究虽也表明FAC参与调节细胞凋亡，但不通过p53依赖的途径。其理由有二：在MMC存在时，超量表达突变p53不影响FAC淋巴细胞系和非FA淋巴细胞系细胞的生存，在MMC存在或不存在时，FAC淋巴细胞系和非FA淋巴细胞系细胞Bcl-2（调节p53表达）表达无差别。人MO7e和鼠32D细胞为IL-3依赖细胞系，在缺乏IL-3的培养基中培养，它们会凋亡；超量表达FAC可延迟其凋亡。Whitney等^[15]研究FAC造血祖细胞的生长，分化和调亡，发现FAC细胞对干扰素（IFN）异常敏感，IFN通过诱导Fas蛋白表达导致造血祖细胞凋亡。在低浓度的IFN的作用下FAC CD34⁺细胞的CFU-GM和BFU-E产率明显下降，而此浓度对正常CD34⁺集落形成无影响。抗Fas的抗体可拮抗IFN的作用，改善CFU-GM和BFU-E的产率。因此，认为FAC蛋白参与调节IFN信号系统，进而通过Fas途径调节细胞凋亡，综上所述，得出以下假设：正常的FAC基因依据骨髓微环境细胞因子的波动调节细胞凋亡，维持正常的造血功能，FAC患者因FAC功能缺陷，致使其造血祖细胞死亡加速，最终导致造血功能衰竭。

　　分析FAC患者的基因，发现各种不同突变，有框移突变（frameshift mutation），剪接点突变（splice site mutation），错义突变（missense mutation），终止突变（chain termination mutation）等，且分布于不同的DNA区域^[5,16,17]，见图1^[2]。FAC标准参照细胞系HSC536来源于一位杂合子患者，其两条等位基因的突变不同，分别为L554P（引起FAC蛋白失活）和327bp缺失（使细胞不能合成FAC蛋白）。

　　Auerbach等^[2]分析FAC基因型与表现型的关系，发现基因缺陷与临床表现一定关系，并将FAC分为三组：①有IVS4突变组（n=20）；②有外显子14突变如R548X，L554P组（n=16）；③有外显子1突变如322delG，Q13X，而无外显因子14突变组（n=17）。

　　IVS4或外显子14突变的患者造血系统发生异常和发展为AML的年龄均比较早，平均分别为10.8和15.9岁，预后差，而外显子1突变组发展为AML，平均为21.9岁。

Fig1 Nucleotide sequence changes in the FAC gene.A schematic diagram of the 14 coding exons of gene is provided with the pathogenic mutations shown above and with the polymorphisms shown below the diagram^[2]

Fig2 Some mutations detected in the FAA gene^[2]

FAA及其基因

　　继克隆出FAC后，Lo Ten Foe等^[18]用同样的方法克隆出FAA cDNA，同时另一组研究者用定位克隆法和家系分析也克隆出FAA cDNA，其长度为5.4kb，ORF为4348bp，1.1kb的3＇UTR，31-nt的5＇UTR。FAA基因座定位于染色体16q24.3的区域，长超过80kb不等^[18-20]。

　　FAA编码一个160kD（1455个氨基酸），其结构不同于任何已知蛋白质，FAA功能尚不清。Kuryt等^[21]发现不同的细胞中FAA蛋白的所处的亚细胞位置不同，在肾293细胞中FAA位于胞浆，而在COS细胞中FAA却位于细胞核。

　　分析欧洲97例FA患者的突变，在基因的各个区域均发现突变，28名患者中有27种突变，他们包括框移突变，终止突变，剪切点突变，错义突变和大的缺失突变（large deletion）分布。其中最多的突变是1263delF，5个无亲缘关系的患者为此突变。另有13个错义突变，因在一例正常人中查出此类突变，尚无法肯定是病理突变还是基因的多态性，见图2^[22]。

　　FAA分子缺陷与临床表现的关系尚不清。

FAA与FAC

　　D＇Andrea等研究FAA与FAC的关系，发现FAA和FAC形成复合物。未形成复合物前FAA和FAC位于细胞浆，而FAA-FAC复合物却位于细胞核。突变后的FAC蛋白丧失了与FAA结合的能力，提示不同的FA基因产物可能通过某种方式共同发挥作用。

血液系统嵌合体现象

　　在FA患者的血中同进存在两群细胞，一群对MMC等交联剂敏感，为FA样细胞，另一群对MMC等交联剂不敏感，为表现“正常”的细胞，这种现象称为嵌合现象（mosaicism）。从这样的病人建立的B淋巴细胞系统常为MMC耐药株，而其成纤维细胞系仍对MMC敏感，最近Lo ten Foe等^[23]研究一例女性FAC嵌合体患者的耐MMC的B淋巴细胞系，探讨其嵌合形成机制。该患者为杂合子，两条等体基因分别含有两个不同的框移突变：322delG（外显子1）和1806 insA（外显子14）。研究发现在有丝分裂中，染色体互换重组，重组部位位于两个突变之间的染色体区域，结果使两个突变位于同一条等位基因上，而另一条等位基因恢复正常，产生了耐MMC的逆转细胞。嵌合现象的临床意义尚不清。分析这样的病人，发现有些嵌合现象患者无血液系统导演或血液系统异常很轻，少数嵌合现象病人随年龄的增长，其正常细胞比例增加，FA样细胞减少，相应的临床血液系统异常也逐渐减轻，甚至缓解。因此推测，逆转细胞有生长优势。如果逆转细胞为造血细胞，可正常造血，将改善患者的血液学状况，这也许是基因治疗的天然模型，然而，也有的一些嵌合体病人仍发展为严重的血液病。

FA的基因治疗

　　FAC基因的克隆使基因治疗成为缺乏适当供体的FAC患者的选择。Walsh等^[24]在体外用逆转录病毒载体正常的FAC基因转导入FAC患者的造血干（祖）细胞中，可纠正FAC患者的造血干（祖）细胞对MMC的敏感，而且纠正了的FAC造血细胞具有生长和扩增优势。Joenje等^[23]研究嵌合现象时也发现部分嵌合现象病人血液系统异常较轻，提示逆转的FA造血细胞具有生长优势。Liu依据以上结果，提出假设：将体外导入正常FAC基因的患者造血干细胞回输给患者。虽然这样的基因治疗纠正的造血细胞不多，但由于其具有生长优势，有可能逐步替代缺陷的FA造血细胞，控制患者的造血系统，使患者造血恢复。据此，对一例FAC患儿进行了基因治疗的Ⅰ期临床试验，他们采集患者的外周血白细胞，用免疫磁珠法富集CD34⁺细胞，在体外用逆转录病毒载体导入正常的FAC基因，然后将这些CD34⁺细胞回输给患者。这样的治疗每三个月一次，共一年。在最初的观察中发现治疗后患者骨髓和外周血中均可查到纠正的CD34⁺细胞，骨髓细胞学观察及临床症状也有改善，而且无论有无MMC存在，患者CFU-GM和CFU-E等集落数均增加^[24]。该基因治疗最后疗效评价尚待公布。

　　Fu等^[25]也进行了FAA基因治疗的基础研究，分别将4.3kb和5.5kb的FAAc dNA克隆于PG1逆转录病毒载体中，然后转导FAA的CD34⁺细胞。结果发现转导后的CD34⁺细胞集落形成高于对照组，集落大小也大于对照组；而且在低浓度的MMC存在下，转导后的CD34⁺细胞可形成集落，而对照组CD34⁺细胞则不能。FAA基因治疗的研究，至今尚未开展。

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　Fanconi＇s Anemia and Its molecular Biology

XIE Yan

(Department of Hematology,the First Affiliated Hospital of Hubei medical University Wuhan 430060)

　　Abstract

　　Fanconi＇s anemia(FA)is an autosomal recessive disorder.FA phenotype is so variable,with considerable overlap with the phenotyaes of a variety of genetic and nongenetic diseases,that diagnosis on the basis of clinical manifestations alone is defficult.Hypersensitiuity of FA cells to the clastogenic effect of crosslinking agents (MMC and DEB)provides a unique cellular marker for the disorder. MMC-and DEB-test have been used as a diagnostic criterion. complementation analysis has shown 8 complementation groups (A-H),while each group might represent distinct disease genes.FAC gene isolated by expression cloning methodology was mapped to chromosome9q22.3.FAA gene cloned by expression cloning methodology and positonal clonig was mapped to the chromosome 16q24.3.FAD was mapped to the chrommosome 3p22-36.FAA is the most prevalent group,accounting for 60 to 66 percent of all FA cases.The genotypes of FAC show certain relationship with its phenocypes. FAC coding region contains 14 exons and leads to predicted protein of 558 amino acids. It is found in the cytoplasm. FAC may play a role in the apoptotic pathway. FAA coding region contains 43 exons and leads to a predicted protein of 1455 amino acids. it is found in both nucleus and cytoplasm. FA patients exhibit hematologic mosaicism. Several mosaic patients have unusually mild or no hematologic symptoms. This suggests that hematopoietic mosaicism may serve as a natural model for gene therapy. Gene therapy for fAC is under investigation in a aphase Ⅰ clinical trial.

　　 Key words fanconi＇s amemia mosaicism complementation group gene therapy

校对时间：99-12-08 　姬颖