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瘢痕表皮细胞的培养及电镜观察
第四军医大学学报1999年第20卷第11期
刘建波 李荟元 郭树忠 张琳西
摘 要 目的：揭示瘢痕表皮细胞的生物特性及其对瘢痕发生、发展的影响．方法：①用低倍透射电镜对增生性瘢痕及正常皮肤的表皮进行对比观察．②对增生性瘢痕的表皮进行培养．③用原位包埋及离心团块两种方法对培养的瘢痕表皮细胞进行透射电镜观察.结果：①增生性瘢痕表皮的细胞层次及细胞器均较正常皮肤表皮的少．②培养的瘢痕表皮细胞与正常皮肤的表皮细胞在细胞结构及生长特性上无明显差异．③原位包埋法较离心法技术要求高，但更能准确反映细胞间的连接特征．结论：与正常表皮细胞相比，瘢痕表皮细胞保持着正常的增殖能力．
关键词：表皮细胞 瘢痕,肥大性 细胞培养 透射电镜
0 引言
增生性瘢痕发生、发展的机制及其预防和治疗均是我们亟待深入认识和解决的难题．以往基础研究主要涉及临床瘢痕标本的各项检测及瘢痕来源成纤维细胞的培养．临床工作中注意到，中厚皮供区创面自行愈合后，瘢痕增生较明显；而对此创面进行刃厚植皮或应用培养的表皮细胞膜片均可促进创面愈合，减少瘢痕形成．新生表皮后期即成为瘢痕表皮，是否这种表皮丧失了限制瘢痕增生的能力呢？以往缺乏这方面的研究．为了系列研究正常表皮及瘢痕表皮是否直接或通过其分泌的细胞因子等机制对瘢痕的发生、发展产生影响，我们首先对瘢痕表皮细胞进行了培养并做了电镜观察．
1 材料和方法
1.1 增生性瘢痕及正常皮肤表皮的对比透射电镜观察 取烧伤后16 mo 20岁男性患者肘部增生性瘢痕及腹部全厚皮供区部分正常皮肤，按透射电镜常规进行标本处理及低倍电镜观察．
1.2 增生性瘢痕表皮细胞的培养 无菌条件下将上述瘢痕标本的表皮及下方少部分瘢痕用利刀削下，用小剪刀剪成部分相连的细条状，2.5 g/L Dispense Ⅱ（中性蛋白酶）4℃冰箱中冷消化过夜，用小镊子将瘢痕表皮撕下，2.5 g/L胰酶轻轻吹打5 min，见瓶内液体混浊，弃去残余皮片，1000 r/min，离心10 min，吸除胰酶后用含100 mL/L小牛血清DMEM洗涤，1000 r/min再次离心10 min，弃上清，细胞团块用含庆大霉素的角朊细胞无血清培养基(美国GIBCO公司)吹打均匀,血球计数板计数并计算细胞活率（台盼蓝法）同时计算瘢痕表皮面积，悬液移入数个25 mL培养瓶（其中一瓶装有盖玻片）调整终密度为1.2×108个/L,移入恒温CO2孵箱,3 d换液1次，每日取一瓶计数，连续7 d，绘制生长曲线．以同样方法对正常皮肤表皮进行培养，设为对照．
1.3 培养的瘢痕表皮细胞电镜标本制作 离心法按常规操作进行，原位包埋法后固定、脱水、浸透时间较前者略提前，包埋后直接制备超薄切片．
表1 原位包埋与离心团块法所用时间(min)长短的差别
tab1 Differentiationo of in situ embedded method from centrifugal method
| Methods |
Postfixation |
500 mL/L
acetone |
700 mL/L
acetone |
900 mL/L
acetone |
1000 mL/L
acetone |
1000 mL/L
acetone add embedding
material |
| In situ embedded method(min) |
40 |
5 |
5 |
5×2 |
5×2 |
15 |
| Centrifugal method(min) |
60 |
10 |
10 |
10×2 |
10×2 |
30 |
2 结果
2.1 增生性瘢痕与正常皮肤标本对比观察 与以往文献描述相同．和正常皮肤相比，瘢痕表皮细胞层次少，基底层薄，各种细胞器欠发达．
2.2 瘢痕表皮与正常皮肤表皮细胞培养对比观察 与正常皮肤表皮细胞相比，瘢痕表皮细胞含量低（1×105个/cm2）正常皮肤表皮细胞含量高（1×106个/cm2）．瘢痕表皮细胞悬液的活率约为40%，而正常皮肤活率为71%，但细胞增殖速率则很接近（Fig 1），t检验P＞0.05．
图 1 细胞生长曲线
fig 1 Cell proliferation curve
2.3 培养细胞电镜观察 两种方法均可见到瘢痕表皮细胞内线粒体，内质网等细胞器发达程度与正常皮肤表皮近似，但以离心团块法结构更清晰；原位包埋法观察到细胞间的桥粒连接结构较多而离心法则可见桥粒极少．
3 讨论
培养细胞的透射电镜观察，通过原位包埋技术，可以更直接地观察到细胞间的连接等特性，更直接地反映细胞生长的自然状态，尤其是细胞间的相互关系，但技术要求较高，切片数受限．一旦失败很容易丢失珍贵标本．而离心法因细胞数量较大，可制切片较多，方法安全可靠，可供仔细研究亚细胞结构．但同时也丢失了细胞间连接及其实际形态等大量信息，如有条件，应尽量将两种方法结合并用．
临床工作中，中厚皮供区创面自愈后，常见大量增生性瘢痕遗留．其愈合机制是通过毛囊、汗腺等残存的皮肤附件的表皮增殖扩展，最后相互连结，愈合时间在10 d左右．而此类创面上植以刃厚皮片，愈合时间能提前3 d～5 d．究其原因仅仅是因为缩短了愈合时间及炎症过程，还是所植刃厚皮片提供了某些“因子”阻止了增生过程的启动；而自愈创面的新生表皮则缺乏此类“因子”，值得我们进一步探索．
根据实验结果，瘢痕表皮的层次及细胞活率较低，但增生能力却与正常表皮基本相同，是否可理解为，瘢痕表皮细胞是处于一种营养缺乏状态，而转到营养丰富的培养基中则恢复了其生长特性．瘢痕表皮未能限制瘢痕增生是因为最初新生的表皮细胞尚无此功能，待逐渐成熟时却因真皮的增生使其处于营养缺乏状态，细胞功能受限，故丧失了限制瘢痕增生的能力．而移植的表皮是成熟的表皮细胞，具有限制真皮增生的能力，因此可以使中厚皮供区无瘢痕增生．目前，我们治疗瘢痕的外用药主要都是抑制真皮（瘢痕）增生的药物，但我们还不知道这些药有多少能越过表皮到达真皮而起作用．如果以上假说成立，我们外用一些营养表皮的药物，使表皮很快成熟或保持正常功能，这种方式也许会更直接、有效．
作者简介：刘建波，男，1963-07-24生，主治医师，博士研究生，发表论文5篇，导师李荟元教授，电话：（029）3375305
作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心，陕西，西安,710033
参考文献
1 吕银慧，王仁鹏．培养人表皮细胞的原位包埋超薄切片法．第三军医大学学报，1995；17（3）：245-246
2 喻德军，卫连坤，王高松 et al．体外培养表皮细胞膜片移植平面部磨削创面的临床应用．中华皮肤科杂志，1991；24（5）：348-349
3 司徒镇强，吴军正主编．细胞培养．西安:世界图书出版公司,1996:109-115
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