S-亚硝基硫醇的生理意义分析方法

　　国外医学临床生物化学与检验学分册 1999年第20卷第2期

湖北省黄冈卫生党校（436100）周剑涛* 吴友才** 何香

　　摘 要 S-亚硝基硫醇作为一氧化氮的中间代谢形式普遍存在生物体系中，对NO的舒张血管、防止血小板粘连聚集等效应有调节意义。准确测定S-亚硝基硫醇对于完整地认识体现NO代谢是重要的，化学发光法、荧光光谱法、高效毛细管电泳法等是目前直接测定S-亚硝基硫醇应用的方法。

　　关键词：S-亚硝基硫醇；一氧化氮；生理意义；测定方法

　　S-亚硝基硫醇（S-nitrosothiols或thionitrites）是硫醇（R-SH）化合物的NO取代物（RSNO）。随着NO生物医学的深入研究，RSNO在NO代谢过程中的重要作用逐渐被认识，促进了人们对RSNO具有的生理意义及检测方法的研究。

　　1 人体内的RSNO

　　一般而言，含有硫基（-SH）的化合物均有可能形成RSNO。普遍存在于机体内的RSNO主要有小分子的S-亚硝基半胱氨酸（S-nitrosocysteine, Cys-SNO）与S-亚硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione, GSNO）、大分子的S-亚硝基白蛋白（S-nitrosoalbumin, Alb-SNO）与S-亚硝基血红蛋白（S-nitrosohaem-oglobin, Hb-SNO）等。

　　血液及部分组织或细胞中某些RSNO的浓度水平已有报道^[1]。血样本贮存2～3周后，测得血浆Alb-SNO浓度为0.25～1.0μmol/L，若样本采集后即刻测定，其浓度会更高一些。血浆Cys-SNO浓度为0.3μmol/L，但波动性大于Alb-SNO。血浆中GSNO浓度范围为0.12～0.18μmol/L。气道粘液中GSNO浓度范围为0.25μmol/L（正常人体），肺炎患者为4.0μmol/L，肺移植患者在移植后为0.8μmol/L。体外膜肺(ECMO)患者气道粘液中似乎缺乏GSNO。红细胞内Hb-SNO含量在动脉血和静脉血之间为0.3μmol/L，而静脉血中仅为0.03μmol/L。

　　Stamler指出^[2]，Hb在肺部通过直接与NO反应或通过血中RSNO（如GSNO）转亚硝基作用形式Hb-SNO。

　　Hb-SH+RSNO→Hb-SNO+RSH

　　NO与Hb两个半胱氨酸的巯基结合形成Hb-SNO的反应称为Hb亚硝化作用，该过程依赖于Hb的构象状态，作为一种变构效应伴随Hb的氧合作用^[3]，R型（Relaxed form）Hb较T型(taut form)Hb的亚硝基化程度高。

　　2 RSNO的生理意义

　　 RSNO是生物体内NO供体（NO donors）之一。Rubanyi等曾认为^[4]，内皮衍化松驰因子（EDRF）是Cys-SNO而不是NO，由于Cys-SNO很容易分解成为Cys和NO，当时未能得到证实。目前，实验证明激活鸟苷酸环化酶（GC）产生生物效应的是游离NO，但游离NO可来源于RSNO。NO合酶（NOS）催化L-精氨酸产生的NO以结合形式（如RSNO）释放出来，结合状态的NO不像游离NO易被血液中NO捕捉剂捕获，在需要的时候可释放NO介导GC激活过程。

　　 动、静脉血中Hb-SNO含量的显蓍差异也表明，在微循环中，Hb-SNO作为NO供体可调节血管张力，即NO的舒血管特性。在组织低氧环境，Hb变构，氧亲和力降低，释放氧同时去亚硝基化。Lancaster曾运用Fick氏第二扩散定律对血管壁中NO扩散性质进行分析^[5]，认为血管中游离NO将被Hb捕获, 以致NO水平降至GC的Km值以下。如果血管局部产生的NO被血液Hb捕捉，就不表现出舒血管效应，那么，Hb-SNO在脱氧时释放NO就有重要意义。总之，激活GC的NO可能是局部产生的，也可以由Hb-SNO等供体释放，究竟哪种来源为主，可能依赖于血管类型。

　　 RSNO较NO的半寿期长，且具有NO抗血小板粘附及聚集的效应。Mendelsohn等认为RSNO通过释放NO激活GC，引起血小板内cGMP水平升高，抑制人血小板粘附于纤维胶原蛋白和人内皮细胞，也降低大鼠体内ADP诱导的血小板聚集作用^[6]。即RSNO具有防止血小板粘连聚集作用。GSNO的血小板抑制活性大于NO和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（S-nitroso-N-acetylpenicillamine, SNAP），GSNO是目前有效的药用NO供体之一。

　　 RSNO曾被认为是非肾上腺能非胆碱能（NANC）神经的递质。Gibson和Barbier等报道GSNO是小鼠肛尾肌和大鼠胃底部NANC神经释放的递质^[7,8]。NANC神经支配的平滑肌舒张作用能被NOS抑制剂阻断，然而能消除外源性NO舒张效应的NO捕捉剂对此无影响。如生成超氧离子的物质能灭活外源性NO，对NANC诱导的大鼠胃底部和小鼠肛尾肌的舒张作用没有影响。Liu等指出^[9]RSNO可能参与阴茎勃起，也可能与调节支气管平滑肌张力有关。不过，RSNO直接作为NANC神经递质的观点未能被广泛接受。

　　3 RSNO的测定方法

　　3.1 RSNO的性质 RSNO水溶液在330～350nm和540～600nm有吸收峰^[1,10]，利用光吸收特性可能来监测实验条件，RSNO生成或分解状态，也可用于定量分析。

　　 RSNO通过S-N键均裂产生NO和相应二硫化合物（RSSR）^[10]。根据这一性质采用检测NO及其NO代谢产物(NO2—，NO3—)­­的一系列分析技术间接测定RSNO。不过，室温条件下RSNO水溶液比较稳定。用金属离子，如10-6mol/L铜离子能有效地加速RSNO分解。Dicks等认为发生有效催化作用的是Cu(Ⅰ)而不是Cu(Ⅱ)^[11]。Gordge等报道^[12]，选择性Cu(Ⅰ络合剂能降低RSNO抗血小板聚集作用。

　　可见光和紫外光（UV）也加速RSNO分解.。可见光引起GSNO释放NO，因此用于体外GSNO研究的生物材料应避光培养^[13]。UV分解RSNO对分析测定RSNO极有意义，等基于UV分解-S-N键的特点，建立了一种有效的RSNO检测系统。

　　目前，RSNO的测定方法有直接测定法和间接测定法。一般而言，适合NO分析测定的方法可用于RSNO的间接测定，诸如化学发光法、NO2—与NO3—法、高铁血红蛋白法，电子自旋共振波谱法、电化学法等^[14]，本文不再赘述。以下介绍几种直接测定RSNO的分析方法。

　　3.2 光解-化学发光法^[15](photolysis-chemilumi-nescence) 该方法建立在NO化学发光法基础之上，包括光解断裂S-NO键和化学发光法检测NO两个过程。样本通过HPLC或GC分离系统进入光分解器，利用UV（如365nm）使RSNO中的S-NO键均裂产生NO，NO随隋性气体进入化学发光仪与臭氧（O3）发生化学反应生成激发态NO2（NO2*），后者以光子形式释放能量返回基态，采用敏感的光电倍增管检测该过程中光子发射强度，以此确定NO含量。

　　NO＋O3→NO2*+O2

　　NO2*→NO2+hv

　　根据化学发光仪检测前是否经过光解作用可以区别游离NO与RSNO和其它的NO衍生物，该法检测下限为10-9mol/L，变异系数＜2%，可以满足生理性和药理条件下细胞、血桨中的RSNO的测定。由于光解-化学发光法综合地利用了HPLC或GC的高分辨率，UV特异性断裂RSNO分子中S-N键、NO与O3高反应特异性和化学发光法的高灵敏度。所以，目前认为该方法是测定RSNO的最佳方法之一。

　　3.3 荧光光谱法^[11](spectrofluorometric method ) RSNO（如GSNO）水溶液(pH1)在334nm和544nm有吸收峰，但摩尔吸光系数极低，分别为890和16，检测灵敏度远不能满足生理水平需要。为了提高检测灵敏度，Gabor等利用“内滤光效应”(innerfilter effect)，采用荧光光谱法测定RSNO含量。RSNO本身无荧光性质，Gabor选用硫酸喹啉作为荧光剂，因为硫酸喹啉与RSNO在334nm有最大重迭吸收峰。硫酸喹啉与RSNO吸收334nm波长符合Lambert-Beer定律，所以两者吸收光的相对量可通过334nm波长处吸收系数比值确定。RSNO影响硫酸喹啉对激发光的吸收，导致其发射光(453nm)强度变化。即在一定条件下，RSNO含量越大，硫酸喹啉发射荧光强度越小。由于NO与RSH生成RSNO是化学计量反应，所以该方法既适合检测生理条件细胞和体液中NO含量，又适合RSNO（如GSNO）和硫醇（如谷胱苷肽）含量的测定。

　　3.4 高效毛细管电泳(high-performance capiuary electrophoresis, HPCE) HPCE技术以高分辨率、快速、微量为其特点，在分析多种体液中大小成份方面已显出独特的优势^[16]，在高电压（10～30kV）条件，HPCE也适合分离分析硫醇及相应RSNO和二硫化物。但是，目前用HPCE分析RSNO，其灵敏度还未达到人体生理水平，另外，分析不同的硫醇衍生物需要调整电场条件和缓冲液pH值，故还不能同时用来分析硫醇衍生物^[17]。所以，HPCE测定RSNO尚需要进一步改进。可以预计，随着HPCE自动分析仪的推广与应用，测定分析条件的不断完善，HPCE技术将会更好地用于RSNO的研究。

　　*作者简介：周剑涛，男，44岁，本科，学士。现任副主任技师，主持黄冈市临床检验中心工作及从事生物化学、生物化学检验技术教学。

　　**湖北省黄冈市一医院检验科

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(98-04-10收稿)

录入：邰 燕

校对：马海茸