交联型异体脱细胞真皮基质的研制及动物复合皮移植实验

　　第四军医大学学报1999年第20卷第5期

姜笃银　陈璧　苏映军　胡大海　贾赤宇

　　摘　要　目的：寻找适合烧伤创面移植的异体脱细胞真皮基质（allo-ADM）.方法：将薄中厚小猪皮采用胰蛋白酶等消化，制成含基底膜的ADM，再作组织学等检测和猪复合移植实验.结果：①allo-ADM具有无细胞、无细菌、低毒性等特点. ②戊二醛不同交联时间组的ADM，与自体薄中厚皮片重叠移植于猪全层皮肤切除的创面上，皮片成活率为100%，早期观察无排斥反应，外观平整；5 wk时组织学结构完整，炎性反应轻，随交联时间延长，allo-ADM内浸润生长的成纤维细胞、血管内皮细胞和炎性细胞逐渐减少，而未经交联的allo-ADM组织内炎性反应重，组织降解迅速.结论：发挥真皮支架作用的allo-ADM，宜采用低浓度戊二醛等作短时间的化学交联处理.

　　关键词：脱细胞真皮基质　复合皮　皮肤移植

　　0　引言

　　大面积烧伤患者供皮区有限，常采用网状自体薄厚皮片(autologeus thin split-thickness skin, auto-TTS)或刃厚皮、微粒皮等移植覆盖切/削痂创面. 由于皮片薄，缺少有效的真皮成分和引导性组织再生作用，皮片成活后常有不同程度的瘢痕增生和挛缩畸形，后者在关节功能部位尤为明显. 自1988年起，我们采用胰蛋白酶去细胞方法，制成有活性的异体小猪、乳猪真皮、异体胎儿真皮和成人真皮，经与auto-TTS重组复合皮肤(composite skin, CS)移植实验和临床应用观察^［1～4］，较好地克服了上述单纯auto-TTS移植存在的缺限. 由于组织内残留少数异体附件上皮细胞、微血管内皮细胞(microvascullare endothelial cell, mVEC)等组织细胞，移植后仍是宿主免疫排异反应的主要目标. 为寻求理想的真皮替代物，我们采用胰蛋白酶和EDTA等处理，去除异体薄中厚皮片上的所有细胞，制成含基底膜（BM）的无细胞真皮基质(allogeneic acellular dermal matrix, allo-ADM)，通过对戊二醛交联的allo-ADM进行移植前组织学等检验和动物移植实验，探讨临床allo-ADM与auto-TTS复合移植的可行性.

　　1　材料和方法

　　1.1　allo-ADM的制备　25 kg左右的健康小白猪经活杀、肥皂水洗刷和去毛后，剥取全层皮肤，去脂后入1 g/L新洁尔灭液内浸泡15 min，无菌生理盐水冲洗，取皮鼓反取约0.25 mm薄中厚皮片，采用胰蛋白酶、EDTA和Triton X-100或SDS等复合消化液，去除表皮和真皮内所有细胞成分，清洗后经2 mL/L戊二醛（德国进口）水溶液交联和网状打孔后，装袋封口，Co⁶⁰100 Gy剂量照射后备用. 移植前检查allo-ADM的物理性状，作组织学（HE，PAS）、细菌培养、细胞毒性分析和扫描电镜观察.

　　1.2　　实验动物　　选择本院猪场2月龄小白猪3头，体重10 kg～15 kg，2雌1雄. CS中发挥真皮支架作用的allo-ADM，依据2 mL/L戊二醛水溶液交联时间的不同，设未经戊二醛交联即CS（CS₁）组、5 min交联CS（CS₂）组、10 min交联CS（CS₃）组、20 min交联CS（CS₄）组和40 min交联CS（CS₅）组，并以单纯auto-TTS移植为对照，每组移植6块. 30 g/L戊巴比妥钠肌注麻醉后，常规备皮、消毒和铺巾. 于猪脊柱两侧美蓝划线，设计4.0 cm×8.0 cm大小、上下两排各3块创面，相互间隔2 cm，每猪共12块创面. 自深筋膜层切取全层皮肤，再用取皮鼓反取厚约0.1 mm皮片作auto-TTS使用. 创面经充分止血和清洗，先移植allo-ADM，其上重叠移植auto-TTS，另以单纯auto-TTS移植为对照(Fig 1). 各组皮片移植部位的机率均等，移植后分别打包包扎，绷带和弹力网套固定. 以术后2 wk首次打开创面时的观察记录为准，表皮和真皮成活95%以上者视为全部成活，40%以下者为未成活，二者之间为部分成活，数据作Ridit分析. 5 wk时检测皮片收缩和弹性程度，以切口线为准，检测皮片面积大小(mm²)，数据作t检验.

　　1.3　检测指标　①组织学：首次打开创面后，每周用直径3 mm活检针穿刺留取标本，入40 g/L多聚甲醛缓冲液（pH7.4)内固定，石蜡包埋，5 μm 连续组织切片，常规作HE,PAS和VG染色. ②免疫组化染色：同上标本，以山羊血清和PBS替代第一抗体作阴性对照. 用兔抗人von willebrand factor (vwF) IgG(1∶200, Dako)进行SABC（kit,武汉博士德公司）免疫组化，DAB显色和苏木精衬染，阳性结果呈棕黄色，分布于mVEC胞浆内，背景无色或淡黄. 以术后5 wk时组织学和免疫组化染色结果为研究重点，高倍镜（×400）下用网格测微器（5/25）观察allo-ADM 5个不同视野内浸润生长的成纤维细胞(Fb),mVEC和炎性细胞的平均密度（cells/mm²），以及allo-ADM及其上下各0.2 mm范围内自体组织的微血管在单位面积网格上的交叉点数的均数（交叉点数/mm²），以此作为微血管密度（MVD）. 统计学作方差分析和单因素相关分析.

　　2　结果

　　移植前ADM交联前柔软有弹性，呈磁白色，交联后呈乳白色或乳黄色，厚度和韧性均增加，随交联时间的延长，上述性状更趋明显. 将ADM剪碎后临床送检，报告无细菌生长. 细胞毒性试验：24孔细胞培养板内，将ADM用DMEM反复浸洗后，于其BM面上接种正常人包皮Fb和角朊细胞，细胞贴壁率低，生长迟缓. 但交联型ADM再经胰蛋白酶消化或鼠尾胶原包被后，接种上述细胞的贴壁率和生长速度均明显提高. 交联前后ADM与正常小猪真皮和人真皮细胞外基质的组织形态学结构十分相近. BM特殊染色法显示ADM表面有薄层BM和波浪起伏的皮钉凹陷及乳头结构，未见细胞和毛囊等附件结构，少见细胞核物质. 扫描电镜观察ADM表皮显示面均质细腻的BM，由于乳头突起和皮钉凹陷，显现规律的凹凸不平，未见表皮基底细胞附着. ADM的真皮面部分胶原纤维断裂，但排列整齐，间有大小均匀的孔隙.

　　allo-ADM动物移植术后2 wk首次打开创面换药，除2块CS₅和1块CS₄为部分成活外，余各组皮片均完全成活(Fig 2)，与auto-TTS组比较无显著性差异(Ridit, P＞0.05). 术后5 wk时CS表面平滑，创面轻度收缩，各组皮片面积比较无显著性差异(t, P＞0.05)，但每组皮片靠近猪后肢腹侧的一块皮片皱缩很明显，已不足原移植面积的60%，可能与猪卧姿休息时后肢屈曲导致皮片明显收缩有关. auto-TTS和allo-ADM均成活，胶原排列有序. allo-ADM浅层的auto-TTS早期血供来自于allo-ADM的网孔，其内可见毛细血管丰富的结蒂组织“蒂”或“桥”样结构(Fig 3)，交联型allo-ADM内浸润生长的Fb,mVEC和炎性细胞较未交联allo-ADM明显减少(Fig 4a,4b)；CS₁组的allo-ADM内上述细胞密度高，原有的胶原结构破坏，胶原嗜酸性弱，与上下的自体组织完全融合，5 wk时已难以分辩. 而其它各组allo-ADM结构完整，胶原嗜酸性强，与自体组织界限明显，在allo-ADM的BM与auto-TTS连接面上有明显的水肿间隔(Fig 3)；微血管沿网孔大多垂直表皮面方向生长. allo-ADM周围的自体组织内的MVD较高，尤以网孔“蒂”部和皮下组织层明显(Fig 5). allo-ADM内自体Fb,mVEC和炎性细胞密度及MVD随戊二醛交联时间的增加而逐渐减少(t, P＜0.01, Tab 1,2).

　　allo-ADM内浸润生长的细胞数和CS组织中的MVD与戊二醛交联时间单因素相关性分析，r值如Tab 1,2所示，经t_r检验，各值均呈明显负相关(P＜0.001).

　　图 1　猪复合皮（CS）移植术中

　　fig 1　CS in transplantation

　　(a: CS₃, b: CS₄, c: CS₅, d: auto-TTS); CS: Composite skin; auto-TTS: autologeus thin thickness skin.

2　CS移植术后5 wk时外观

　　Fig 2　Appearance of CS, 5 weeks after graft

　3　CS₃组移植5 wk时的组织学结构

　　Fig　3　Histology of CS₃ group, 5 wk after graft　HE　×100( *：oedema, ↑：pedicel-like structure of capillary vessels in mesh allo-ADM, ?：basement membrane surface of allo-ADM)

　4　allo-ADM内细胞密度比较

　　fig 4　Comparison of cell density in allogeneic acellular dermal matrix)

　　(a: CS₁, b:CS₃)

5　allo-ADM网孔内毛细血管

　　fig 5　Capillary vessels in mesh allo-ADM　vwF　×400

　　表 1　CS移植5 wk时allo-ADM内的细胞密度

　　Tab 1　Cell density in allo-ADM， 5 wk after CS transplantation

(n=6， X±s ，cells/mm²)

　　CS：composite skin,mVEC:microvasullare endothelial cell. 表 2　移植5 wk时CS组织中MVD

　　Tab 2　MVD in CS tissue， 5 wk after tansplantation

(n=6，X±s，cross-points/mm²)

　　CS:The same as Tab1,Auto-TTS:antologeus thin splite-thickness skin,Allo-ADM:allogeneic acellular dermal matrix.3　讨论

　　真皮替代物的研制和开发，促进了复合皮的临床应用. Heck等^［5］和Cuono等^［6］最早应用异体真皮作为自体表皮移植的载体，复合移植于动物和临床烧伤切痂创面，取得满意的效果. 近年研究发现，异体真皮内的附件上皮细胞、郎格罕细胞和mVEC等具有Ⅱ型组织抗原是宿主产生免疫排斥的主要原因，由此推动了异体真皮无细胞化的研究. Mekay等^［7］用DispaseⅡ处理甘油保存的异体真皮，临床应用显示皮片成活后瘢痕少等优点. Wainwright^［8］报告，脱细胞异体真皮与网状自体薄厚皮片复合移植取得更优的临床效果，并将脱细胞异体真皮以“AlloDerm”名称商品化. Tompkins等^［9］ 用动物胶原和6-硫酸软骨素等合成与正常皮肤真皮相似的三维结构的双层人工皮——Integra（商品名），在移植建立血运后，Ⅱ期移植自体薄皮片，已获得成功. 目前已有多种人工真皮替代物（如Burk皮、Bell皮和Integra等）问世，但由于认识和合成条件的限制，这些产品均难与天然真皮细胞外基质的形态结构相媲美.

　　我们采用胰蛋白酶、EDTA和Triton X-100或SDS等消化处理新鲜薄中厚猪皮，可完全去除表皮和真皮内各种细胞成分，保留异体真皮结构，与Tukami等^［10］结果一致. 经组织学、细菌和细胞培养证实，该真皮替代物是含BM的无菌、无细胞、低毒性和以胶原为主的细胞外基质. 动物移植结果表明，交联型allo-ADM与auto-TTS一次性重叠移植成活率高，未见水泡和排异反应，allo-ADM胶原排列整齐，炎性细胞少，可见宿主Fb，mVEC长入，近期外观皮片表面平滑、收缩少，触软，是一种较理想的永久性真皮替代物.

　　BM在创伤愈合和培养表皮细胞粘附等方面起着重要作用^［11］. 由于徒手取皮刀或电动取皮机等，均无法保证所取的auto-TTS不附带BM和真皮成分，因而在含BM的allo-ADM表面再重叠移植含BM结构的auto-TTS，组织学显示在allo-ADM与auto-TTS结合处连接较差，且有水肿间隔. 该结果提示：allo-ADM附带BM，可能更有利于（培养的）自体表皮片的粘附和真皮-表皮连接结构的再生，对已附带BM的auto-TTS则无必要，且可能影响皮片成活. 我们以往临床应用不含BM的胎儿和成人异体真皮与auto-TTS重叠移植后，皮片质量好，很少发现皮片脆裂和起水泡问题^［4］，从另一方面说明，allo-ADM含有BM对auto-TTS移植的意义不大.

　　不同CS组的皮片外观，成活率和收缩等未见显著性差异，但组织学和免疫组化染色结果显示，相同浓度的戊二醛，随交联时间的延长，allo-ADM厚度、韧性和颜色均逐渐增加，移植后与自体组织分界明显，其内浸润生长的宿主细胞(Fb,mVEC和炎性细胞）数也逐渐减少，后者与交联时间成负相关；而未交联的allo-ADM内上述细胞密度显著增多，失去原有胶原结构. 临床上长时间交联的allo-ADM复合移植后出现auto-TTS网孔内上皮爬行十分缓慢，甚或出现CS长期干结，需1 mo～2 mo时间在allo-ADM下出现上皮化，即戊二醛皮的“占位性”现象，结合实验室在allo-ADM上直接接种Fb和角朊细胞，细胞贴壁率和生长速率均很低的结果，我们认为戊二醛皮片的这种“占位性”的本质可能就是allo-ADM中醛基（—CHO）的毒性作用. 由此也能很好地解释以往认为戊二醛具有降低组织抗原性、减缓组织降解等作用的机理，即组织中醛基的毒性作用，阻碍Fb,mVEC单核—巨噬细胞等细胞的浸润生长和胶原酶等蛋白酶的分泌. 如何利用醛基交联作用，既降低异种/异体ADM的免疫炎性反应，减缓组织降解，又可使交联型allo-ADM的细胞毒性降低至最低程度，提高CS移植的成活率，是我们今后研究的重点. 本实验结果提示，2 mL/L戊二醛交联allo-ADM的时间宜控制在5 min～10 min之间，并在交联后宜作适当的处理，或采取先交联，后反取和酶消化等处理步骤，可能更有利于交联型allo-ADM的粘附和CS的成活. CS移植早期auto-TTS主要靠allo-ADM网孔内血管“蒂”样结构提供血运，说明allo-ADM网状打孔的必要性.

　　基金项目:国家自然科学基金资助项目　No.39070822

　　作者简介:姜笃银，男，1963-02-04生，江苏省泰州市人，汉族，1987年第四军医大学毕业，1997年第四军医大学外科学烧伤专业博士,主治医师，发表论文16篇. Tel:(029)3251734　Fax:(029)3251734　E-mail　burns @ fmmu.edu.cn

　　作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心烧伤外科, 陕西 西安 710033

　　参考文献

　　1 姜笃银，陈　璧，徐明达et al. 复合皮移植后皮片生长和收缩情况的监测. 中华整形烧伤外科杂志, 1998;14(1):48-52

　　2 陈　璧，汤朝武，龚　熙et al.复合皮移植实验研究. 中华整形烧伤外科杂志,1990;7(1):29-30

　　3 姜笃银，陈　璧，汤朝武et al. 复合皮移植猪动物模型的建立. 第四军医大学学报, 1996; 17(4):280-283

　　4 姜笃银，陈　璧，徐明达et al. 冷冻异体胎儿真皮—自体表皮复合移植在Ⅲ度烧伤切痂创面的应用. 第四军医大学学报, 1997;18(5):461-463

　　5 Heck MA, Bergstresser PR, Baxter CR. Composite skin grafts: frozon dermal allografts support the engrafement and expansion of autologous epidermis. J Trauma， 1985;25(2):106-112

　　6 Cuono CB. Composite autologous-allogenele skin replacement: development and clinical application. Plast Reconstr Surg, 1987;80(6):624-635

　　7 Mekay I, Woodward B, Wood K et al. Reconstruction of human skin from glycerel preserved allodermis and cultrued keratinocyte sheets. Burns, 1994;20(1):19-22

　　8 Wainwright DJ. Use of an acellular allograft dermal matrix (AlloDerm) in the management of full-thickness burns. Burns, 1995; 21(4):243-248

　　9 Tompkins RG, Burke JF. Progress in burn treatment and the use of artificial skin. World J Surg, 1990;14(7):819

　　10 Takami T, Matsuda M, Yoshitake et al. Dispase detergent treated dermal as a dermal substitute. Burns, 1996; 22(2):182-190

　　11 Chetty BV, Boissy RE, Warden GD et al. Basement membrane and fibroblast aberration inblisters at the donor, graft and spontaneously healed sites in patients with burns. Arch Dermatol, 1992;128(2):181-186