|
IL-2和(或)IL-3重组腺病毒直接体内注射对大剂量化疗后小鼠造血功能恢复的影响
中华血液学杂志 1998年第2期第19卷 论 著
作者：于敏 曹雪涛 杨建民 章卫平 张明徽 孟沛霖
关键词： 白细胞介素2；白细胞介素3；重组腺病毒；基因疗法；造血恢复；药物疗法
摘要 目的：检测应用直接腹腔注射白细胞介素2(IL-2)重组腺病毒和(或)白细胞介素3(IL-3)重组腺病毒方法对化疗后小鼠造血功能恢复的影响。方法：正常小鼠腹腔注射大剂量环磷酰胺(200mg/kg)24小时后,直接腹腔注射IL-2重组腺病毒(Ad-IL-2)和(或)IL-3重组腺病毒(Ad-IL-3)，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测相应细胞内细胞因子mRNA，并持续观察小鼠外周血白细胞、股骨单个核细胞、骨髓CFU-GM的恢复情况。结果：腹腔注射Ad-IL-2和(或)Ad-IL-3组小鼠腹腔细胞可测及相应细胞因子mRNA,血清中可测及相应细胞因子;腹腔注射Ad-IL-3组小鼠外周血白细胞、股骨单个核细胞、骨髓CFU-GM最低值均显著提高(P＜0.05),但腹腔注射Ad-IL-2组小鼠对化疗后小鼠造血功能无明显影响,联合应用Ad-IL-2和Ad-IL-3与单独应用Ad-IL-3相比无显著性差异。结论：腹腔直接注射Ad-IL-3能促进化疗后小鼠造血功能的恢复。
The effects of intraperitoneal injection of IL-2 recombinant adenovirus and/or IL-3 recombinant adenovirus on the hematological recovery of murine model receiving high dose chemotherapy Yu Min，Cao Xuetao，Yang Jianmin,et al.Department of Hematology,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433
Abstract Objective: To investigate the effect of Ad-IL-2 and/or Ad-IL-3 on the hematological recovery of murine model receiving high dose chemotherapy.Methods: Ad-IL-2 and/or Ad-IL-3 were i.p.injected into experimental mice after high dose cyclophosphamide(200mg/kg). RT-PCR analysis of peritoneal cells and cytokine levels in murine serum were detected to confirm gene transfering.The number of peripheral WBC,femur MNC and CFU-GM in bone marrow were observed continuously.Results:After i.p. injection of Ad-IL-2 and/or Ad-IL-3 , the transfected IL-2 and IL-3 gene were identified by RT-PCR analysis of peritoneal cells, high level of IL-2 and/or IL-3 were detected in murine serum.After i.p. injection of Ad-IL-3, the number of WBC ,femur MNC and CFU-GM in bone marrow significantly increased,while i.p. injection of Ad-IL-2 had no effect on improving hematological recovery. And the effect of i.p. injection of both Ad-IL-2 and Ad-IL-3 was not significantly different from that of injection either of them.Conclusion:i.p. injection of Ad-IL-3 can increase hematological recovery after high dose chemotherapy.
Key Words Interleukin-2 Interleukin-3 Recombinant adenovirus Gene therapy Hematological recovery Chemotherapy
白细胞介素(IL)-2具有广泛的生物学活性，能够有效地激活特异性和非特异性肿瘤杀伤机制［1，2］；IL-3具有较强的造血调控作用,能显著促进造血前体细胞的分化成熟，且具有一定的免疫调节能力［3～5］。我们已发现直接腹腔注射IL-2重组腺病毒(Ad-IL-2)和IL-3重组腺病毒(Ad-IL-3)对大剂量化疗后小鼠免疫功能的恢复有明显的促进作用,可激活小鼠腹腔巨噬细胞及NK细胞的活性。在此基础上，我们观察了大剂量化疗后小鼠腹腔直接注射Ad-IL-2、Ad-IL-3后造血功能恢复情况。
材料和方法
1 主要试剂 Ad-IL-2和Ad-IL-3的扩增和滴度测定由本校免疫学教研室完成,重组腺病毒载体由Hamada博士惠赠；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自Gibco公司。IL-2,IL-3标准品购自Boehringer公司,小鼠IL-2,小鼠IL-3 RT-PCR引物序列如下:
mIL-2：5′-TATGCATCCGAGACAATGGTTC-3′；
5′-CGAATTCTCAGACTTTAGGTGC-3′
mIL-3：5′-TCCACTTCAAGCTCTACAG-3′；
5′-GAGTCAAATCCACAACATGCC-3′
2 细胞株及实验动物 IL-2依赖细胞株CTLL、IL-3依赖细胞株32D由免疫学教研室常规传代培养。C57BL/6小鼠,雄性,6～8周,购自上海西普尔-必凯实验动物公司。
3 小鼠外周血白细胞、中性粒细胞，骨髓单个核细胞、CFU-GM动态恢复的检测 C57BL/6小鼠实验当天(0天)腹腔内注射环磷酰胺(Cy)200mg/kg，24小时后随机分5组，每组24只，分别给予不同治疗。 1组: 为对照组，每只小鼠腹腔注射RPMI 1640 0.5ml；2组: 为载体对照组，腹腔注射Lac Z重组腺病毒(Ad-Lac Z)，每只1×107pfu；3组:腹腔内注射Ad-IL-2，每只1×107pfu；4组: 腹腔内注射Ad-IL-3，每只1×107 pfu；5组:腹腔内分别注射Ad-IL-2和Ad-IL-3，每只各1×107 pfu。
实验第0,1,2,3,4,6,9,11,13,15,17天,取各组小鼠外周血作白细胞计数，常规涂片分类。实验第1, 3, 5, 7, 10,12,15,21天,每个时间点各组取3只小鼠，断颈处死小鼠取股骨，每组小鼠3根股骨混合，用5ml无血清RPMI 1640培养基冲出有核细胞，通过4号针头，制成单细胞悬液计数，算出每根股骨的单个核细胞数，以单个核细胞/股骨表示。
CFU-GM体外半固体培养法:根据Iscove等方法加以改进，培养体系如下：小牛血清0.2ml,条件培养基 0.1ml,骨髓细胞 0.1ml(浓度配成2×105/ml),MC 0.3ml,IMDM补足至1ml，混匀后加入96孔板，每孔0.1ml，5%CO2、37℃完全饱和湿度培养5～7天，40个以上细胞为一集落计数，每孔集落数以CFU-GM/2×104表示。
4 小鼠腹腔及血清中IL-2,IL-3水平的检测 详见文献［6］。
5 小鼠腹腔细胞IL-2,IL-3 mRNA表达的检测 腹腔注射重组腺病毒10天后,处死小鼠取混合腹腔细胞,用异硫氰酸胍一步法抽提细胞总RNA作为模板，按RT-PCR试剂盒中步骤操作，凝胶电泳鉴定RT-PCR产物。
6 统计学处理 采用未配对计量资料的t检验。
结 果
1 小鼠腹腔细胞IL-2,IL-3 mRNA表达 RT-PCR产物经电泳显示，Ad-IL-2,Ad-IL-3组小鼠腹腔细胞RT-PCR后在200bp、500bp左右各见一条清晰条带，应用RPMI 1640 Ad-Lac Z组小鼠腹腔细胞RT-PCR后在相应部位未见条带，联合应用Ad-IL-2,Ad-IL-3组腹腔细胞RT-PCR后两条带均清晰可见(图1)。
1：Ad-IL-2+Ad-IL-3组；2：Ad-IL-3组；3：Lac Z组；4：Marker；
5：Lac Z组；6：Ad-IL-2组；7：Ad-IL-2+Ad-IL-3组
图1 小鼠腹腔细胞IL-2，IL-3 RT-PCR分析
2 不同治疗组血清中IL-2,IL-3水平检测结果 见表1。
表1 不同治疗组小鼠血清中IL-2,IL-3水平( ±s)
| 组 别 |
IL-2水平
(×103U/L) |
IL-3水平
(×103U/L) |
| RPMI 1640 |
0 |
0 |
| Ad-Lac Z |
0 |
0 |
| Ad-IL-2 |
383.3±21.5 |
0 |
| Ad-IL-3 |
0 |
256.5±19.1 |
| Ad-IL-2+IL-3 |
475.2±32.7 |
280.1±24.5 |
3 各治疗组小鼠外周血白细胞、中性粒细胞恢复状况 各治疗组小鼠白细胞计数变化如图2所示,中性粒细胞变化如表2所示。各组白细胞和中性粒细胞恢复呈相似趋势,第6天开始上升,Ad-IL-3及联合应用Ad-IL-2,Ad-IL-3组白细胞第9天恢复正常,RPMI 1640,Ad-Lac Z,Ad-IL-2组白细胞第13天基本恢复正常,应用Ad-IL-3组与未用Ad-IL-3组间差异显著(P＜0.05),而 Ad-IL-3联合应用Ad-IL-2组与Ad-IL-3组之间无明显差异(P＞0.05)。
表2 腹腔注射Ad-IL-2和(或)Ad-IL-3对化疗后小鼠外周血中性粒细胞恢复的影响
| 时间
(天) |
中性粒细胞比例(±s) |
| RPMI 1640 |
Ad-Lac Z |
Ad-IL-2 |
Ad-IL-3 |
Ad-IL-2+IL-3 |
| 1 |
0.72±0.032 |
0.62±0.048 |
0.54±0.042 |
0.60±0.035 |
0.68±0.06 |
| 2 |
0.62±0.054 |
0.58±0.027 |
0.60±0.012 |
0.68±0.021 |
0.62±0.07 |
| 3 |
0.50±0.023 |
0.52±0.087 |
0.50±0.021 |
0.50±0.042 |
0.52±0.017 |
| 4 |
0.50±0.015 |
0.54±0.045 |
0.56±0.057 |
0.60±0.039 |
0.58±0.037 |
| 6 |
0.80±0.058 |
0.78±0.043 |
0.84±0.052 |
0.90±0.019 |
0.88±0.043 |
| 9 |
0.68±0.043 |
0.65±0.032 |
0.70±0.054 |
0.82±0.054 |
0.73±0.084 |
| 11 |
0.52±0.057 |
0.60±0.054 |
0.63±0.055 |
0.68±0.037 |
0.60±0.054 |
| 13 |
0.60±0.038 |
0.62±0.071 |
0.58±0.037 |
0.72±0.015 |
0.68±0.038 |
图2 腹腔注射Ad-IL-2和(或)Ad-IL-3对化疗后
小鼠外周血白细胞恢复的影响
4 各治疗组小鼠骨髓单个核细胞数的恢复 如图3所示,各组股骨骨髓有核细胞数恢复趋势相似,在第3天降至最低后开始上升,Ad-IL-3组及联合应用Ad-IL-2组股骨单个核细胞数于第10天基本恢复(与对照组相比有显著差异,P＜0.05),而对照组15天才基本恢复。
5 各治疗组小鼠骨髓CFU-GM的恢复 如图4所示,CFU-GM在用Cy后呈现先下降后上升再下降的趋势,反映了Cy对骨髓的损伤和机体代偿作用的综合结果。化疗后第3天CFU-GM反跳至最高后于第7天降至最低,下降幅度以对照组为大。第15天治疗组CFU-GM已基本恢复正常,而对照组于化疗后第21天尚未完全恢复。
图3 腹腔注射Ad-IL-2和(或)Ad-IL-3对化疗后
小鼠股骨有核细胞恢复的影响
图4 腹腔注射Ad-IL-2和(或)Ad-IL-3对化疗后
小鼠骨髓CFU-GM恢复的影响
讨 论
放、化疗后尽快地促进骨髓造血恢复，缩短
骨髓空虚期，减少感染和出血等并发症的发生，是治疗恶性血液病成功的关键问题之一。细胞因子对加速造血恢复，减少感染等并发症方面已取得了明显的效果。但由于重组细胞因子存在体内半衰期短、应用剂量大、毒副作用大等缺点，使其临床应用受到限制。细胞因子基因治疗为放、化疗后造血及免疫功能的迅速恢复开辟了新的途径。以往应用逆转录病毒介导的细胞因子基因治疗时往往由于运用回体(ex vivo)方法进行,即取出体内细胞转基因后再回输体内，且转染效率较低，转染的靶细胞必须为分裂期细胞等缺点，始终难以广泛开展。在本实验中，我们利用腺病毒载体扩增快、转染范围广，可转入静止期细胞及不整合入宿主细胞的优点，克服了以往重组细胞因子治疗及逆转录病毒介导的基因治疗的缺点，使其更为方便和高效［7］。在小鼠接受Cy化疗造成骨髓抑制后注射携带IL-2基因或IL-3基因的腺病毒载体。结果证实使腺病毒携带的IL-2,IL-3基因能广泛转入腹腔细胞中并高水平地分泌。
应用细胞因子基因治疗中，靶细胞的选择对机体的安全性非常重要，尽管IL-3具有很强的刺激造血细胞的功能，但它是否参与机体处于持续稳定状态下的正常造血调控尚需进一步研究证实。Wong等［8］发现在逆转录病毒介导下将小鼠IL-3基因转入小鼠造血干细胞中，再将其移植入小鼠体内，会出现白血病样反应，外周血白细胞数极度升高。推测可能是由于IL-3可显著促进造血干细胞的增殖分化所致。本实验中，由于应用腺病毒载体进行治疗，虽然能将基因导入多种靶细胞中，短期内分泌水平较高，但由于腺病毒载体导入的基因不进行整合，容易丢失，不存在长期刺激造血干细胞增殖的可能，在本实验中未发现类白血病样反应。对各处理组造血恢复的动态观察发现化疗后骨髓白细胞,单个核细胞,CFU-GM呈现相继恢复的趋势，注射Ad-IL-3小鼠的恢复显著早于其它组，联合应用Ad-IL-2和Ad-IL-3并不能进一步促进化疗后小鼠的造血恢复。应用Ad-IL-3组CFU-GM比未用组下降的程度轻,而此后的恢复过程中，应用Ad-IL-3组明显快于其它组，说明IL-3对Cy后小鼠骨髓的粒单系祖细胞有促进早期恢复的作用。骨髓单个核细胞的恢复与CFU-GM的恢复有一定的相关性。提示单个核细胞的上升速度可能在一定程度上反映了造血细胞增殖和分化的趋势。应用Ad-IL-3组小鼠外周血白细胞第9天起即已基本恢复，而骨髓单个核细胞的恢复较外周血晚，这可能与IL-3能强烈动员造血干细胞从骨髓释放入血有关，但具体机制尚待进一步研究。应用Ad-IL-2基因治疗对小鼠造血功能无明显影响。
基于腺病毒介导的IL-3基因治疗对化疗所致的骨髓损伤有一定的保护作用并能有效地促进化疗后骨髓造血的恢复,且联合IL-2重组腺病毒腹腔内注射能促进化疗后免疫功能的恢复,从而为加大化疗剂量,提高化疗效果提供保障,具有潜在的临床应用价值。
参 考 文 献
1 Rosenberg SA.Immunotherapy and gene thrapy of cancer.Cancer Res,1991，51(Suppl):5073-5075.
2 For R,Guarini A,Gansbacr B.IL-2 treatment for cancer:from biology to gene therapy.Br J Cancer,1992,66:992.
3 Metcalf D,Begley CG,Johnson GR,et al.Effects of purified bacterialy synthesized murine multi-CSF(IL-3) on hematopoiesis in normal mice. Blood,1986,68:48-51.
4 曹雪涛编著.白细胞介素2的基础与临床.北京:北京科学技术出版社,1990.80-92.
5 曹雪涛,章卫平,蔡荣,等.成纤维细胞介导的IL-3基因疗法的体内IL-3水平及其增加外周血细胞数量的动态观察.中国肿瘤生物治疗杂志,1995,2:16-18.
6 章卫平,曹雪涛.一种快速、简便、敏感、特异的白细胞介素2,3,6生物学检测法:MTS/PMS法的建立.中国免疫学杂志,1994,10:148-150.
7 Peter WP. The effect of recombinant human colony-stimulating factors on hematopoietic reconstitution following autologous bone marrow transplantation.Semin Hematol,1989,261(Suppl2):18-22.
8 Wong JPC,Chung S,Dumbar CE,et al.Retrovirus mediated transfer and expression of the interlekin-3 gene in mouse hematopoietic cells result in a myelo-proliferative disorder.Mol Cell Biol,1989,87:18-23.
(收稿：1996-08-16 修回：1997-09-19)
(校对：董文革)?
|
