p53基因突变与EB病毒相关性鼻咽部T细胞淋巴瘤

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第6期

高子芬　姜芬　潘增刚　王洪海　田君才

　　 摘　要　目的：了解p53基因突变与埃伯斯坦－巴尔病毒（EBV）相关性鼻咽部T细胞淋巴瘤（NPT）的关系。方法：应用免疫组织化学方法（SABC），原位杂交（ISH），PCR－SSCP对26例确诊为鼻咽部T细胞淋巴瘤的病例进行p53蛋白及基因的检测。结果：EBV编码的小RNA探针（EBER）17/26例阳性（65.4％）；p53蛋白13/26例阳性（50％）；对其中12例进行p53外显子5，7，8的PCR－SSCP检测，发现p53突变7/12例(58.3％)阳性，EBV阳性组5/8例阳性（62.5％），阴性组2/4例（50％）阳性，外显子5突变4/12例(33.3％)阳性，外显子7突变1/12例(8.3％)阳性，外显子8突变3/12例(25％)阳性，其中1例同时发生5，8两个外显子突变；EBER/p53蛋白表达同时发生有11例，不发生7例，EBER＋/p53－6例，EBER－/p53＋2例；EBER表达（ISH）与p53基因突变（PCR－SSCP）同时发生5例，不发生2例，EBER＋/p53－(PCR－SSCP)3例，EBER－/p53＋(PCR－SSCP)2例；以p53蛋白检测为标准，p53基因突变（PCR－SSCP）与p53蛋白表达（SABC）符合率83％，敏感率为85.7％，假阴性率20％。结论：鼻咽部T细胞淋巴瘤（NPT）EBV感染与p53基因突变无明显相关性。

　　关键词：EBV　p53　EBER　鼻咽部　T细胞淋巴瘤

　　鼻咽部T细胞淋巴瘤与EB病毒相关性近年研究活跃^[1～3]，主要集中于EBV的检出，流行病学的调查，但对癌基因方面的研究较少。作者在多年对鼻咽部淋巴瘤病因发病研究的基础上，进行EBV相关性鼻咽部T细胞淋巴瘤p53基因突变的研究，探讨EBV感染后p53基因突变的情况及与p53蛋白表达的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　26例鼻咽部T细胞淋巴瘤选自北京医科大学病理学系及空军总医院外检档案及会诊材料，其中鼻腔13例，鼻咽8例，咽部5例。除1例女性外均为男性。年龄18～99岁，平均47.21岁。所有标本经10％福尔马林固定，石蜡包埋及HE染色。

　　1.2　免疫组化

　　方法为标准SABC法，鼠抗人p53单克隆抗体（DO－7）购自DAKO公司。切片经脱蜡到水，微波抗原修复（700W5分钟×2次，自然冷却至室温）。一抗4℃过夜，DAB显色。阳性对照为已知p53阳性的乳腺癌病例。

　　1.3　原位杂交

　　探针选用EBV编码的小mRNA(EBER,DAKOY017)。主要步骤：1)石蜡切片脱蜡到水；2)蛋白酶K消化（4mg/L,37℃,30分钟），酒精脱水，空气干燥；3)滴加荧光素标记的EBER探针（EBER－FITC)5μl，加硅化盖玻片，37℃，杂交2小时；4)Triton－x100洗，滴加碱性磷酸酶（AP）标记的抗荧光素抗体（DAKOK046)1:50,30分钟；5)底物缓冲液孵育，BCIP/NBT显色；6)甲基绿复染。阳性对照为已知EBER阳性的霍奇金病例。阴性对照组为TBS替代EBV探针。

　　1.4　PCR

　　主要步骤：1)切5μm厚10片石蜡包埋组织，二甲苯脱蜡2小时×3次，无水乙醇30分钟×3次；2)400μl Lysis buffer,8μl20mg/ml蛋白酶K消化（55℃至组织消化完全）；3)酚氯仿（1:1）抽提蛋白质；4)1/5体积3MNAAC(pH5.2)二倍体积无水乙醇，－20℃过夜，沉淀DNA；5)三蒸水溶解DNA，测OD值了解DNA浓度。

　　反应体系：25UL体系,DNA模板1μg，上下游引物各0.5μl(25mmol/L)，dNTP(4mmol/L)1μl,10×buffer2.5μl,Taq酶0.1μl,ddH2O19.9μl。

　　反应条件：水浴PCR仪94℃45秒,56℃45秒,72℃45秒,35个循环，72℃5分钟。

　　电泳：50V,1.5％琼脂糖。

　　1.5　SSCP

　　1)配胶30％Acr－bis(59:1)5.3ml,ddH2O10.5ml,5×TBE4ml,10％AP130μl,TEMED10μl;2)变性：5μlPCR产物与5μl loading buffer(95％去离子甲酰胺，10mmol/LEDTApH8.0,0.05％溴酚蓝，0.05％二甲苯氰蓝）混匀，95℃10分钟，冰浴5～7分钟；3)电泳：恒压50V，恒温15℃12小时；4)固定，染色，显色，终止，封胶分析结果。每次电泳都以正常DNA扩增产物做阳性对照，若样品电泳条带比正常增多，减少或位置变动，即为突变。

　　2　结果

　　2.1　p53蛋白表达（SABC）

　　阳性信号主要位于肿瘤细胞核内（图1），同时有些瘤细胞胞浆内亦可见p53蛋白表达。13/26例(50％)阳性，表达程度可分三级，＋:视野内阳性细胞10％～30％，着色较弱；＋＋:视野内阳性细胞30％～60％，着色较深；＋＋＋:视野内阳性细胞60％，和（或）着色很深。＋:5/26例，＋＋:4/26例，＋＋＋:4/26例。

图1　p53蛋白免疫组化结果。阳性信号位于细胞核内，呈粗棕黄色颗粒。SABC法DAB　×200

　　2.2　EBER表达（ISH）

　　EBV－EBER阳性信号位于瘤细胞胞核上，呈深蓝紫色（图2）。阳性17/26例(65.4％)。根据阳性细胞占整个视野内肿瘤细胞百分比定量分析，结果在10％～90％之间。

图2　EBV－EBER原位杂交结果。阳性信号位于细胞核内，呈蓝紫色颗粒。ISHBCIP/NBT　×100

　　2.3　p53突变（PCR－SSCP）

　　对其中的12例进行了p53突变的检测，7/12例(58.3％)阳性，外显子5突变4/12例(33.3％)阳性，外显子7突变1/12例(8.3％)阳性，外显子8突变3/12例(25％)阳性，其中1例同时发生5,8外显子突变（图3,4）。

图3　PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果M:marker,

　　1:exon5 181bp,2:exon7 171bp,3:exon8 204bp

图4　PCR－SSCP结果N为正常对照。T1为肿瘤，呈泳动变位，T2为肿瘤，条带增加

　　2.4　EBER表达（ISH）与p53蛋白表达（SABC）相关性

　　二者同时表达有11例，皆不表达有7例；EBER＋/p53－6例，EBER－/p53＋2例。统计学分析EBER表达（ISH）与p53蛋白表达（SABC）缺乏相关性，见表1。

表1　EBV感染与p53蛋白表达的关系

　χ2=0.40　＜37.65　P＞0.05

　　2.5　EBER表达（ISH）与p53基因突变（PCR－SSCP）相关性

　　二者同时发生有5例，皆不发生有2例，EBER＋/p53－(PCR－SSCP)3例，EBER－/p53＋(PCR－SSCP)2例。统计学分析EBER表达（ISH）与p53基因突变（PCR－SSCP）缺乏相关性，见表2。

表2　EBV感染与p53基因突变的关系

χ2=0.04　＜3.84　P＞0.05

　　2.6　p53基因突变（PCR－SSCP）与p53蛋白表达（SABC）

　　发生p53基因突变和蛋白表达各有6例，皆不发生有4例。p53＋(SABC)/p53－(PCR－SSCP)1例，p53(SABC)/p53＋(PCR－SSCP)1例，PCR－SSCP方法与免疫组化符合率83％，PCR－SSCP敏感率85.7％，假阴性率20％，见表3。

表3　PCR－SSCP检测p53第5～8外显子突变结果与免疫组化染色结果比较

　　3　讨论

　　3.1　p53突变与EBV感染的关系

　　野生型p53蛋白是一种核转录因子，参与细胞周期调控。其生物学功能：1)诱导细胞生长停滞于G1期；2)DNA损伤后诱导调亡^[4,5]；3)抑制肿瘤细胞生长；4)保护遗传稳定性^[6]。野生型p53蛋白半衰期很短，正常细胞含量低，免疫组化方法不能检出。当p53基因突变时，半衰期延长，可用免疫组化方法检出。在多种人恶性肿瘤中p53发生突变或缺失^[7～12]。近年研究表明，一些病毒蛋白LMP－1和细胞蛋白MDM－2可与野生型p53蛋白结合，使其稳定性增加，半衰期延长，亦可用免疫组化方法检出^[13～15]。此外，p53协同基因p33缺失，p53蛋白核定位信号缺失也可导致p53蛋白在核内的堆积。因此，p53蛋白阳性反映两种情况：一是p53基因突变，一是野生p53蛋白含量增加。本文7/12例p53蛋白阳性，其中2例＋，3例＋＋,2例＋＋＋。

　　EBER是一种EB病毒编码的功能性的RNA，对细胞的生长调节起调节作用，它存在于细胞核内，拷贝数高达107/细胞，检测起来比较敏感。因此EBER的检测是EBV感染的有力证据。研究表明鼻咽部T细胞淋巴瘤和EB病毒感染有着很高的相关性。本文17/24例（65.4％）EBER阳性，定量分析阳性细胞率在10％～90％之间，与文献报道一致^[16]。

　　PCR－SSCP原理，通过PCR扩增正常基因及待测基因，变性使其变为单链，即使正常链与待测链仅有一个bp的差别，其构象就不同，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，条带就有差异，待测链电泳条带比正常增多或减少或位置不同，即发生了突变。扩增片段小于200bp时，敏感性可达90％^[17]。p535,6，7,8外显子均小于200bp。5,8,7,6是p53常发生突变的外显子，突变率依次递减，因此，本文选取了5,7,8三个外显子研究，外显子5突变4/12例(33.3％)阳性，外显子7突变1/12例(8.3％)阳性，外显子8突变3/12例(25％)阳性，与文献报道一致。

　　已有文献报道，霍奇金病，皮肤T细胞淋巴瘤中EBV感染与p53突变缺乏相关性^[18]。本文就目前结果显示，鼻咽部T细胞淋巴瘤（NPT）中EBV感染与p53蛋白及基因改变无明显相关性，这种共性是由于样本的原因还是有共同内在机制尚有待于进一步探讨；但是EBV感染与p53蛋白及基因改变无相关性并不排除EBV编码的LMP－1,EBNA－2及其它蛋白，进而影响p53,MDM－2，这也需进一步的研究；至于p53突变致瘤的机制是否是通过影响其下游p21的突变，将做进一步探讨。

　　3.2　p53蛋白改变与p53基因突变的关系

　　以p53蛋白的检测为标准进行分析，p53基因突变（PCR－SSCP）与p53蛋白表达（SABC）符合率为83％，敏感率85.7％，假阴性率20％。因此p53蛋白表达（SABC）一定程度上反映了p53基因突变（PCR－SSCP)，但二者又有差异，这是因为近年来研究表明有使p53蛋白稳定性增加的因素存在，所以可用免疫组化方法检出，实际p53并未突变。另外PCR－SSCP检测p53突变虽然敏感，但是：1)对于p53整个外显子缺失尚不能检出。2)本实验未检外显子6,9等。3)SSCP本身敏感性所致。总之，免疫组化（SABC）检测p53突变，简便易行，有一定意义，但有一定局限性 。PCR－SSCP检测p53突变步骤复杂，但极为敏感。当用两种方法检测均为阳性时，提示p53发生了突变。

　　基金项目：本文课题受卫生部科学研究基金(96－1－259)资助

　　作者单位：高子芬　姜芬　潘增刚　北京医科大学病理学系（北京市　100083）

　　王洪海　解放军空军总医院病理科

　　田君才　甘肃省酒泉地区医院

参考文献

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