聚甲基丙烯酸羟乙酯-Ⅲ型胶原烧伤贴膜的研制(Ⅰ)

http://www.51daifu.com 日期：2007年03月05日  来源：医生在线

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聚甲基丙烯酸羟乙酯-Ⅲ型胶原烧伤贴膜的研制(Ⅰ) 　　第二军医大学学报1999年第20卷第4期 　　蒋长敏　蒋雪涛　魏红　赵长文 　　摘　要　目的: 研究胶原蛋白的性质及聚甲基丙烯酸羟乙酯[poly(HEMA)]-Ⅲ型胶原烧伤贴膜的制备方法。方法: 从小牛皮中提取Ⅲ型胶原蛋白，与poly(HEMA)、乙二醇混合，用过硫酸铵和偏亚硫酸钠引发交联反应，制成烧伤用贴膜；在膜中加入药物吲哚美辛，并做体外溶出实验。结果: poly (HEMA)-Ⅲ型胶原贴膜具有良好的弹性、柔软性、吸湿性和粘附性；吲哚美辛的体外累积释放百分量-时间曲线表明，其多孔的海绵状结构是良好的药物释放系统。结论: poly(HEMA)-Ⅲ型胶原的复合物是制备烧伤用创面敷料的良好材料。 　　 　　关键词：Ⅲ型胶原　聚甲基丙烯酸羟乙酯　烧伤　创面敷料 　　胶原作为一种新的生物材料，已越来越多地应用于医学领域。胶原蛋白与组织具有良好的亲和性，无毒，无刺激，有良好的止血作用，可以多种形式覆盖和保护烧伤创面，并促进创面的愈合，减轻创面的收缩和瘢痕增生。胶原膜是烧伤创面的理想覆盖材料［1］，但胶原蛋白不易成膜。本研究选用甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)作为辅料，通过交联引发剂引发聚合，将Ⅲ型胶原蛋白交织到HEMA的聚合物中，制成具有海绵状结构的烧伤用贴膜，使贴膜既具有胶原蛋白的原有特性，又具有良好的粘附性、吸湿性及机械强度。在贴膜中加入消炎镇痛药吲哚美辛，其骨架结构可使药物在创面持续释放。 　　 1　材料和方法 　　1.1　材料与仪器　小牛皮(上海浦东顾路乡兽医站)；胃蛋白酶(上海生化所东风生化技术公司)；HEMA(上海珊瑚化工厂)；吲哚美辛(上海第十七制药厂)；聚乙烯膜（上海化学试剂商店）；pH 4.3柠檬酸缓冲溶液；pH 7.2磷酸盐缓冲溶液；氯化钠、乙酸、丙酮、乙二醇、过硫酸铵、偏亚硫酸钠、磷酸二氢钠均为分析纯。751-G UV分光光度计 (上海分析仪器厂 )；RCD-G型药物溶出度测定仪 (上海黄河药检仪器厂) ；UV-265型分光光度计 (日本岛津公司)；日立835-50型氨基酸分析仪 (日立公司)。 　　1.2　牛皮Ⅲ型胶原的提取与鉴定　取刚出生即处死的小牛的牛皮，用硫化钠稀溶液浸泡脱毛，剥除皮下脂肪，用水洗净。剪成宽约5mm的碎片，在丙酮中浸泡6h脱脂，再用10%氯化钠溶液浸泡24h，洗净后在0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH4.3)中浸泡48h。弃去浸泡液，用冷的0.5mol/L乙酸溶液匀浆，筛网过滤后在胶原粗提液中加入胃蛋白酶(酶与湿牛皮质量比为1∶400)，消化24h。将消化液高速离心(1×104r/min)5min，上清液用5%氯化钠盐析，所得固态胶原蛋白再用0.5mol/L乙酸溶液溶解。重复上述盐析过程2次。最后，将胶原蛋白溶液装入透析袋中，用0.2mol/L磷酸二氢钠溶液透析48h，再用蒸馏水反复透析至无Cl-。将所得精制液态胶原真空冻干或直接保存于4℃冰箱内备用［2］。取1%胶原溶液用UV分光光度计在190～280nm扫描，测定所制胶原的光密度；用氨基酸分析仪测定胶原的氨基酸组成。 　　1.3　聚甲基丙烯酸羟乙酯　poly(HEMA)-Ⅲ型胶原烧伤贴膜的制备［2］。 　　1.3.1　空白膜的制备　取胶原溶液∶HEMA∶乙二醇 (10∶4∶4)，适量过硫酸铵溶液和偏亚硫酸钠溶液，在研钵中研匀。取适量混合液置于直径60mm平皿内，在37℃恒温水浴中反应3h成膜。用蒸馏水反复冲洗表面，然后平铺于聚乙烯膜上 ，置于真空干燥器中干燥至半透明，再在外层覆盖一层聚乙烯膜，最后4℃冰箱保存。 　　1.3.2　吲哚美辛烧伤贴膜的制备　称取约0.10g吲哚美辛，加入上述处方中，在研钵中研匀。取适量按上述方法制膜，每张膜中含吲哚美辛约18mg，即740μg/cm2。 　　1.4　吲哚美辛烧伤贴膜的体外溶出实验 　　1.4.1　吲哚美辛标准曲线的制备　精称吲哚美辛约0.0504g于100ml容量瓶中，加入甲醇50ml，再用pH7.2磷酸盐缓冲液定容。从中取出5.0ml至50ml容量瓶中，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度。精确吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml至10ml容量瓶中，加磷酸盐缓冲液至刻度，用751-G UV分光光度计于320nm处测定光密度。 　　1.4.2　体外溶出实验　体外溶出实验采用桨板法，溶出介质为900ml磷酸盐缓冲液，温度(37±1)℃，转速50r/min，定时用0.8μm微孔滤膜过滤，抽取5ml溶液，并立即补充相同体积的磷酸盐缓冲液。将滤液直接用UV分光光度计在320nm处测定光密度，并作空白对照。 　　 2　结　果 　　2.1　胶原蛋白的分析鉴定　胶原蛋白的UV扫描结果表明， 样品中的胶原蛋白在232.6nm处呈强烈吸收，符合胶原蛋白的特性。氨基酸含量分析结果见表1。胶原中含总氨基酸为10.57mg/ml，其中含羟脯氨酸为12.0%，符合胶原蛋白的特性［3］。 表1　胶原蛋白中氨基酸的含量分析 　　Tab 1　Contents of amino acids in collagen (ρB /mg·ml－1)

　　

图1　poly(HEMA)-Ⅲ型胶原膜的显微结构 　　Fig 1　Micrographs of the structure of poly(HEMA)-collagen composite 　　A:Stain by ponceau′s and picric acid (×200);B:Stain by ponceau′s and picric acid (×400) 　　2.3　吲哚美辛烧伤贴膜的体外溶出实验　根据吲哚美辛标准曲线的测定结果，得出回归方程为：c=50.4697D+0.0177(r=0.9998)；线性范围5～30μg/ml。吲哚美辛的体外溶出结果见图2，以累积释放百分量(Q%)对时间的平方根(t1/2)回归，得方程：Q(%)=1.1507+38.5406t1/2(r=0.9973) 。从相关系数r可以判断，累积释放百分量与t1/2有良好的线性关系，符合Higuchi方程，说明poly(HEMA)-Ⅲ型胶原复合物具有良好的骨架控释作用。

图2　吲哚美辛累积体外释放百分量-时间曲线 　　Fig 2　Cumulative in vitro release profile of indometacin 　　 3　讨　论 　　对于大面积烧伤的治疗，创面覆盖是一个重要的问题。理想的覆盖材料应该具有以下特点: (1)粘附力强；(2)能促进创面愈合；(3)抗感染［3］。实验证明，胶原蛋白膜为表皮细胞的迁移、增殖铺垫了支架，其丰富的氨基酸有益于创面的局部营养，有利于上皮细胞的增生修复，从而促进创面的愈合。Ⅲ型胶原还具有引起血小板聚集的能力，在凝血过程中起到重要的作用［4,5］。皮肤中主要含有Ⅰ型和Ⅲ型胶原，而幼年动物皮肤中Ⅲ型胶原含量较高［6］。从本实验所选的材料和分析结果来看，小牛皮中胶原的主要成分是Ⅲ型胶原。 　　胶原蛋白的成膜方法，国内报道的主要有盐析法［7］、纱布成膜法［8］、尼龙网筛成膜法［9］等；国外报道最多的是用牛真皮胶原和鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素的共沉淀物作为烧伤贴膜的内层［1］。本实验经过对比，选用poly(HEMA)-胶原复合成膜法来制备烧伤贴膜。poly(HEMA)作为一种人造高分子生物材料，具有良好的亲水性和弹性，主要用于人造角膜；若用于人工合成皮肤，它的粘附性较差，不宜用在全层皮肤损伤的创面。所以本研究将胶原蛋白复合到poly(HEMA)中后，既克服了胶原蛋白和poly(HEMA)原有的缺点，又保留了各自的优点，使烧伤贴膜具有良好的粘附性、吸湿性和抗拉强度。 　　交联反应的温度、胶原与HEMA的比例以及交联引发剂的浓度都对贴膜的理化性质有明显的影响。交联反应温度超过38℃，胶原蛋白易变性；而温度低于36℃，反应产物仍呈胶状，无法成膜。HEMA/胶原的比例过大，所成的膜柔软性和粘附性差；若比例过小，则所成的膜强度低、吸湿性差。交联引发剂的浓度对交联程度影响极大，浓度越大，HEMA的聚合程度越大，所形成膜的空间网状结构就更紧密；反之，则无法引发HEMA的聚合而成膜。 　　本烧伤贴膜的外层是具有一定强度、弹性的聚乙烯膜，在使用中起到支撑和隔离作用，防止外界细菌侵入并保护内层胶原膜。内层胶原膜良好的贴附性和海绵状结构，使其既具有一定的吸湿性，避免创口积液，又能保持创面具有一定的湿润度，有利于肉芽形成和表皮生长，从而加速创面的愈合。有关poly(HEMA)-Ⅲ型胶原烧伤贴膜的理化特性以及对烧伤创面的治疗效果还有待于进一步研究。 　　作者单位：蒋长敏　魏红　赵长文　第二军医大学药学院无机化学教研室，上海，200433 　　蒋雪涛　第二军医大学药学院药剂学教研室 　　作者简介：蒋长敏，男，1968年12月生，讲师 　　参 考 文 献 　　[1]　Boyce ST,Glafkides MC,Foreman TJ,et al.Reduced wound contraction after grafting of full-thickness burns with a collagen and chondroitin-6-sulfate (GAG) dermal skin substitute and coverage with biobrane.J Burn Care Rehabil,1988,9(4):364 　　[2]　Jeyanthi R,Rao KP.Collagen-poly(HEMA) hydrogels for the controlled release of anticancer drugs-preparation and characterization.J Bioactive Compatible Polymers,1990,5(4):194 　　[3]　贾赤宇，陈壁.创面敷料的研究进展.中华整形烧伤外科杂志,1998,14(4):300 　　[4]　李建效.胶原在烧伤创面的应用.国外医学·创伤与外科基本问题分册,1995,16(1):28 　　[5]　Yang JY.Clinical application of collagen sheet YCWM as a burn wound dressing.Burns,1990,16(6):457 　　[6]　杨太美.胶原与创面愈合.国外医学·创伤与外科基本问题分册,1994,15(2):72 　　[7]　高智仁,Im MJ,Sponce RJ.猪真皮胶原膜早期覆盖深Ⅱ度烧伤创面的实验研究.中华整形烧伤外科杂志, 1993,9(4):284 　　[8]　高智仁,李毅，苏青和.胶原凝胶治疗烧伤的临床评价.中华整形烧伤外科杂志,1995,11(3):237 　　[9]　王韦,郇京宁,陈玉林，等.戊二醛胶原人工皮的特点和临床应用.中华整形烧伤外科杂志,1995,11(1):29

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