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Evi1和mds1基因的研究进展
中华血液学杂志
CHINESE JOURNAL OF HEMATOLOGY
1999年第20卷第6期VOL20No6 1999
徐开林综述 王立 郝玉书审校
关键词：Evi1基因 mds1基因 MDS相关基因 白血病
Evi1(ecotropic virus integration site-1) 基因定位于染色体3q26。在小鼠逆转录病毒诱发的急性髓系白血病(AML) 模型中，Evi1是病毒常见的插入位点。Evi1编码一个能结合DNA的锌指蛋白，其过度表达在髓系恶性肿瘤的发生和发展中起重要作用［1,2］。mds1基因，又称MDS相关基因(MDS-associated gene)，最初在骨髓增生异常综合征(MDS)中发现，位于Evi1上游170～400kb处。Evi1和mds1既可各自编码一个单独的蛋白，也能共同编码一个mds1-Evi1融合蛋白［3,4］ 。我们就Evi1和mds1基因的研究进展进行综述。
1 Evi1和mds1基因结构与蛋白
1.1 Evi1基因结构与蛋白：1988年Mucenski等首先在AKXD鼠髓系恶性肿瘤DNA中鉴定出Evi1。人Evi1基因cDNA含3587bp，包括267bp的5′非编码序列，3153bp的开放阅读框和167bp的3′非编码序列。阅读框内两个ATG密码子位于268和290bp，第 2个ATG更接近于恒定的转录起始序列 (GCC)GCC(A/G) CCATGG，很可能是转录起始位点。除开头的78bp外，人与鼠Evi1 cDNA序列的同源性为91%，氨基酸同源性为94%。
Evi1基因编码一个相对分子质量14.5万的蛋白，该蛋白含有10个锌指结构，定位于两个区域，7个锌指定位于氨基端，另3个定位于羧基端，两个区域之间相隔380个氨基酸。在羧基端有一个高度酸性区，与已经发现的转录因子的酸性区极为相似。上述结构特征提示 Evi1 基因产物是一个位点特异的DNA结合蛋白，与RNA的转录调节有关。Matsugi等用抗血清免疫荧光染色法确认 Evi1蛋白定位于核，并证明它能结合双链DNA。用凝胶移位聚合酶链反应进一步证实有一个与 Evi1蛋白对应的高亲和性结合位点，其恒定序列为TGACAAGATAA，全长 Evi1蛋白可特异性地结合到这个位点。
Evi1蛋白还有一种更短的同种型，这种选择性剪接形成的相对分子质量8.8万的同种型在人和鼠均可见，它缺乏锌指6和7。这两个锌指为结合DNA所必需，因此，相对分子质量8.8万与14.5万的Evi1蛋白可能有不同的DNA结合特征［5］。
1.2 mds1和mds1-Evi1基因结构：1994年Nucifora等［3］首先在MDS患者骨髓细胞中鉴定出mds1基因。Fears等［4］证实mds1可以是一个独立的基因，也能与Evi1形成融合基因mds1-Evi1。在后者，Evi1开放阅读框的5′端附加了188个密码子。这个附加区与成视网膜细胞瘤活性锌指蛋白RIZ有大约40%的同源性。mds1转录本大约为1.5和2.0kb，编码一个相对分子质量2.8万的蛋白［1,6,7］。虽然从正常人基因文库中已分离出编码mds1-Evi1的cDNA克隆，但目前仅在转染细胞中用免疫方法检出mds1-Evi1蛋白，在正常组织尚未鉴定出内源性的mds1-Evi1基因产物。
2 Evi1和mds1的造血调控作用
2.1 Evi1和mds1对GATA-1调节及其在红细胞系造血中的作用:锌指蛋白GATA-1是有一定特异性的红系转录调节因子，其结合基序存在于许多红系表达基因的顺式调节元件中，包括珠蛋白基因，红细胞生成素(Epo)基因和GATA-1基因等。因此，GATA-1蛋白在红系特异性基因表达和红系细胞分化中起中心调节因子的作用［8］。例如，它调节β-珠蛋白基因簇控制区的形成及其增强子的作用；通过控制关键酶影响血红素的合成；调节Epo的产生以及Epo受体的表达等［9,10］。
GATA-1锌指区结合位点的基序为WGATAR(W=A或T,R=A或G)，该位点在Evi1氨基端锌指区的恒定结合基序内。Kreider 等［9］证实了Evi1在红系造血中的作用。鼠 32DEpo1 细胞系不表达Evi1 基因，给这些细胞转入含有或不含有Evi1 cDNA的逆转录病毒载体后，转染Evi1表达载体的细胞失去了原有对Epo的反应，红系祖细胞集落形成明显减少。此外，在CAT分析中，Evi1 的表达能明显抑制GATA-1依赖的转录激活作用。该作者认为，Evi1的不适当表达可能通过抑制GATA-1靶基因的某个亚群阻碍了红系造血。
Soderholm等［11］利用报告基因比较了mds1-Evi1和Evi1的作用，进一步证实Evi1抑制了由GATA-1介导的激活作用，而mds1-Evi1则是一个含GATA基序启动子的强激活物。当去除mds1-Evi1氨基端188个氨基酸使之变成Evi1后，就由激活物转变成抑制物。此外，mds1-Evi1本身也受 Evi1 的抑制。
2.2 Evi1对粒系和巨核系细胞的影响:将Evi1转入造血生长因子依赖的小鼠32Dc13细胞后，G-CSF诱导的细胞分化受阻，说明Evi1蛋白能阻碍粒细胞发育成熟。在M1D+细胞系，逆转录病毒在Evi1基因内插入，引起Evi1基因的高表达。但M1D+细胞能够被G-CSF诱导分化为巨噬细胞；在这个试验中，Evi1的高表达对巨噬细胞的分化似乎并无影响。Evi1对巨核细胞分化的作用仍不清楚，近来的研究表明，GATA-1的表达能促进髓系祖细胞系416B细胞向成熟的巨核细胞分化，间接地提示了Evi1对巨核细胞分化的影响［9］。Evi1与三系造血细胞发育异常的关系也受到一些学者的注意。在一些Evi1异常表达或Evi1定位染色体重排的人髓系恶性肿瘤中常有多系造血细胞发育异常［12］。而小巨核细胞更是有3号染色体异常髓系白血病的一个重要特征［12,13］。
2.3 正常造血细胞Evi1和mds1基因的表达:在几乎所有的报道中，正常人骨髓和外周血细胞中均测不到Evi1转录本［14-16］。Nucifora等［3］用Northern印迹杂交法分析了脾脏、胸腺、外周血白细胞、骨髓和T及B淋巴细胞，均未检出mds1转录本。
3 Evi1和mds1与血液系统恶性肿瘤
3.1 t(3;21)白血病及MDS中Evi1和mds1与AML1形成融合基因:t(3;21)(q26;q22)平衡易位首先发现于慢性髓系白血病原始细胞危象(CML-BC)的患者，在CML慢性期(CML-CP)、少数治疗相关AML(t-AML)以及MDS后AML(post-MDS AML)也可见到这种易位［2,3］。此外，在原发性AML或MDS(de novo AML 或 MDS)也均已发现t(3;21)［17,18］。Nucifora等［3］报道，t(3;21)中21号染色体上的AML1基因在runt区和转录激活区之间断裂并分别与mds1和Evi1形成AML1/mds1和AML1/Evi1融合基因。在AML1/Evi1转录本中，AML1的第5个外显子被连接到Evi1的第2个非翻译外显子。AML1/Evi1编码一个相对分子质量18.0万融合蛋白［19］，含3个DNA结合区。mds1与AML1的融合发生在阅读框内，在断裂的AML1上附加了127个氨基酸残基，其中脯氨酸、丝氨酸和酸性氨基酸的百分率较高。此外，AML1还能和mds1-Evi1形成AML1/mds1-Evi1融合基因，在t(3;21)的患者已检出这一种融合基因。AML1/Evi1蛋白致病的分子机制仍不很清楚，但许多研究证实在CML中，它是发生CML-BC的重要机制之一。目前认为，AML1/Evi1有双重功能：阻碍分化和刺激增殖，这可能是它在血液系统恶性肿瘤发生和发展中所起作用的分子基础［20］。许多研究表明，Evi1基因过度表达本身也有阻碍髓系细胞分化，促进其转化的作用［1,9］。AML1/mds1有促进Rat1 A细胞形成肿瘤的作用。在裸鼠表达AML1/mds1的细胞呈瘤样生长，生长速度加快［21］。
3.2 Evi1基因在血液病中的表达：
3.2.1 Evi1在白血病细胞系中的表达：Evi1表达阳性的细胞系有UCSD/AML(造血因子依赖的AML细胞系)，HEL和K562，对HEL和K562作核型分析，有复杂的核型异常，但无3号染色体异常［14］。Evi1表达阴性的细胞系有HL-60细胞，AML-193和AML-OC11。YS 9;22和TS 9;22是从两名Ph+CML-BC的不同个体建系而来，YS 9;22有3号染色体异常，Evi1表达阳性；TS 9;22没有3号染色体异常，没有Evi1基因的表达。Evi1表达阳性的细胞系还有HEC-1-B等，Evi1表达阴性的细胞系还有HAL-01(B前体ALL细胞系)等［15］。最近Hamaguchi等［22］还建立了Evi1表达阳性的细胞系HNT-34。
3.2.2 Evi1在AML和MDS中的表达：各作者报道的Evi1在AML中的表达率不很一致。Russell等［14］报道的18例de novo AML中，3例(17%)有Evi1表达，1例post-MDS AML Evi1表达阳性，Evi1表达阳性的AML均未显示3号染色体异常。另一项报道显示［15］，50例de novo AML中5例有Evi1表达，但均无3q26异常。这5例分别为M1、M2(2例)、M4和M6，其中2例骨髓有三系血细胞发育异常。在23例post-MDS AML中，8例(34.8%)可测到Evi1转录本，其中1例有t(3;4)(q26;q21)。15例ALL中无一例Evi1表达阳性，提示该基因表达有髓系特异性。Morishita等分析116例AML仅8例(7%)测到Evi1转录本。其中7例有3号染色体重排。最近，Xi等［23］还评价了急性早幼粒细胞白血病(APL)患者Evi1基因的表达及其与ATRA治疗的关系。治疗前9例中5例Evi1阳性。2例最初Evi1阴性，用ATRA治疗2～5周后转为阳性。另1例用ATRA治疗4和5周后也检测到了Evi1 mRNA。此外，在体外培养时NB4细胞系不表达Evi1，但经ATRA诱导分化后转为Evi1阳性。上述结果与以前的试验不一致，在以前的研究中，许多作者都发现Evi1的表达阻碍了粒系细胞的分化［1,9］。由此可见Evi1对细胞分化的影响颇为复杂，有待进一步研究加以阐明。
Dreyfus等［16］观察了21例MDS患者，Evi1表达见于难治性贫血(RA，9例中有1例)，RA伴原始细胞增多(RAEB，12例中有7例)和转化中RAEB(RAEB-t)，总表达率为40%。Evi1表达与年龄、性别、血红蛋白水平、骨髓原始粒细胞或原始红细胞百分率之间没有明显的相关性。在一项34例MDS患者研究中，10例Evi1阳性的患者中有8例为RAEB或RAEB-t，后者占RAEB-t的57%。而20例RA中仅2例有Evi1基因表达［15］。我们报道的33例MDS中有16例 (48.5%)Evi1表达阳性，RA、RAEB和RAEB-t患者阳性率分别为12.5%、64.3%和60%［24］；随着MDS患者向白血病转化Evi1表达水平增高，Evi1表达与骨髓小巨核细胞呈正相关。
3.2.3 Evi1在CML中的表达：Ogawa等［25］报道13例CML-CP患者中，仅1例(7.7%)有Evi1过度表达。而14例CML-BC中10例(71%)Evi1过度表达。在检测到Evi1转录本的患者中，除1例无核型资料外，均未发现累及3q26的细胞遗传学异常。Carapeti等［26］分析了28例CML-BC，仅5例测到Evi1转录本，明显低于Ogawa等的阳性率。在Ohyashiki的10例CML-BC中，6例原始粒-巨核细胞危象(CML-myelomeg-BC)患者中3例Evi1阳性，4例原始淋巴细胞危象(CML-lymphoid-BC)患者均为阴性，提示Evi1表达与CML的髓系原始细胞危象有较明显的关系［15］。此外，另有报道结果显示1例有染色体inv(3)的CML-BC患者Evi1表达阳性，体外培养其骨髓细胞，随着向巨噬细胞分化,Evi1表达消失［14］；另1例Evi1阳性的CML-CP很快进展为CML-BC［25］。这些资料进一步支持Evi1可能是发生CML-BC的1个转化基因。
作者单位：300020 天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所［徐开林(现在徐州医学院附属医院)、王立、郝玉书］
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收稿：1998-07-06 修回：1999-01-25
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