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补体C1抑制剂的研究进展
国外医学输血及血液学分册1999年第22卷第4期
吴强 凌云综述 沈慕昌审校
摘要 补体C1抑制剂（C1 inhibitor,C1INH）是丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease Inhibitors, Serpins）“家族”的成员之一，对补体，凝血、纤溶、激肽释放等蛋白酶激活系统有重要的抑制功能。C1INH通过其分子表面的反应中心环与靶酶的活性中心结合形成共价复合物从而达到抑制靶酶活性的作用。C1INH的遗传基因位于11号常染色体的p11.2-q13，遗传基因中的部分缺失、插入，以及单一碱基对的替代，都将导致血浆C1INH水平低下或功能异常。C1INH的遗传性或获得性缺乏与血管神经性水肿有着密切的关系。C1INH浓缩制剂对遗传性或获得性C1INH水平低下患者有治疗作用。
关键词：补体C1抑制剂 丝氨酸蛋白酶抑制剂 遗传性血管神经性水肿 获得性血管神经性水肿
1 C1INH的分子结构及生理功能
补体C1抑制剂（C1 inhibitor,C1INH）是血浆中重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpins）家族成员之一，具有抑制多种丝氨酸内肽酶的活性，与补体、凝血、纤溶和激肽释放的活化与拮抗平衡有密切的联系[1]。C1INH是血浆补体成分C1的唯一抑制剂，通过抑制活化补体成分C1的酯酶活性调节补体活化途径；它也是FⅩⅡa的主要灭活剂，占血浆FⅩⅡa抑制活性的90%；它可抑制血浆中50%的激肽释放酶活性；C1INH亦能抑制纤维蛋白溶解酶的活性，从而对纤溶平衡具有调节作用[2]。
c1INH为单肽链糖蛋白，由478个氨基酸残基组成。肽链的63-97重复出现四肽顺序Glx-Pro-Thr-Thr及其变异结构Glx-Pro-Thr，重复次数高达7次。肽链内有两对二硫键，分别为Cys101-Cys406、Cys108-Cys183。C1INH高度糖基化，糖含量约占分子总量的33%～35%。肽链上连接有约20个侧糖链，大多数糖基（可能是17个）位于肽链的N-末端1-120肽段内，侧糖链中有6个葡萄糖胺基连接（N-糖胺键）。至少有5个半乳糖胺基连接（O-糖胺键），分别连接于Thr26、Ser42、Thr66、Thr70、Thr74。其它可能被糖基化的氨基酸残基为Thr77、Thr84、Thr85、Thr89、Thr93、Thr96、Thr97。完整的C1INH分子量为104kDa，等电点为pH2.7～2.8。血浆中C1INH的含量约为2μMole/L(约220mg/L)[1]。
c1INH主要是在肝脏合成，纤维母细胞、单核细胞、巨核细胞等多种肝外细胞具有合成C1INH的能力。纤维母细胞合成C1INH的能力比单核细胞的能力大30~50倍，INF-γ、INF-β2、TNF等细胞因子能促进C1INH的合成[3]。
c1INH属Serpins家族中的一员，与其它Serpins成员如α1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰凝乳蛋白酶、AT-Ⅲ、HC-Ⅱ等具有不同程度的同源性[2，3]。Perkins等[4]通过中子散射（Neutron scattering）分析，推断C1INH分子由头-尾两结构组成，N-末端的113个氨基酸残基组成棒状尾部结构区，它高度糖基化，无Serpins功能，推测它可能与防止C1自身聚集性自激活、以及在与白细胞表面的结合等方面起作用[4，5]。C-末端的365个残基组成球状头部结构区，是Serpins同源区，具有Serpins的功能。Serpins同源区由8个α-螺旋结构、3个β-折叠结构、1个反应中心环（Reactive central Loop,RCL）以及部分其它无规则结构组成。C1INHR的RCL为A-β-折叠结构的第5肽段（s5A）与C-β-折叠结构第1肽段（s1C）间的连接肽，在C1INH分子表面向外伸展形成一个可折叠的环状结构。RCL长度约为20个氨基酸残基，具有C1-底物结构的相同特征，包括氨基酸顺序、酶反应中心连接特征、柔韧性等，其空间结构与靶酶活性中心的空间结构互补[4，5]。
c1INH的反应中心为肽 链第444-445位的Arg-Thr，位于RCL中。在靶酶抑制过程中，反应中心的P1（Arg444）被靶酶识别、捕获，形成靶酶-抑制剂1：1结合的共价复合物，C1INH的Arg444-Thr445乙酰键被裂解，从C-末端裂解下一个分子量为4kDa的34个氨基酸残基的小肽段，肽键断裂后在P1位产生的新羧基将靶酶反应中心的Ser乙酰化，形成共价复合物，从而直到抑制酶活性的作用[5]。
2 C1INH的分子遗传学特征和变异
c1INH基因位于第11号染色体的p11.2-q13。据推断，C1INH基因全长至少16kb，由8个外显子（Exon）和7个内含子（Intron）组成[6]。C1INH遗传缺陷表现为基因的微小缺失、插入或有限碱基替换，或其它基因的缺陷导致血浆中C1INH被不正常地加工和修饰[7~15]。在HAE的临床诊断中，根据C1INH抗原浓度与活性降低的程度分为Ⅰ型和Ⅱ型HAE。Ⅰ型HAE患者血浆中的C1INH抗原含量以及靶酶抑制活性仅及正常水平的30%~50%[7~9]；而Ⅱ型HAE患者血浆中具有正常、略低或略高的C1INH抗原含量，但靶酶抑制活性却低于正常个体，在Ⅱ型HAE患者的血浆中含有功能异常性C1INH[10~15]。
早期对Ⅰ型HAE患者的C1INH基因的研究发现该类患者有一个异常短的C1INH mRNA。采用PCR技术将患者C1INHmRNA放大分析，提示了从异常C1INH基因衍生出一个较小的160bp dNA，相应于外显子Ⅶ有核苷酸的丢失。因此合成了小于正常分子量的C1INH[7]。
ernst等[8]的研究发现了另一种类型的Ⅰ型C1INH变异。患者C1INH遗传基因外显子Ⅷ中第1414-1433的20个碱基对出现了重复结构，导致了一个正常的终止密码子缺失，产生了一个比正常C1INH多52个氨基酸残基的异型C1INH。将变异型基因重组到纤维母细胞中表达，胞内C1INH的肽链分子量高达98kDa，明显高于正常C1INH基因在纤维母细胞中所表达的肽链分子量（78kDa）；而变异型C1INH表达后分泌发生降解。Ernst等[8]认为这可能起因于异型C1INH的糖基化异常或分泌通道的识别异常导致分泌量减少。
kawachi等[9]报道了一类因内含子单一碱基替代变异所致Ⅰ型HAE。患者C1INH遗传基因第7内含子5-末端链接识别位点发生了T→A单一碱基替代变异，印迹试验证明患者具有正常大小的C1INH mRNA，但量仅及正常个体量的50%。变异基因在转录过程中出现迅速的降解，导致mRNA的含量降低，引发血浆C1INH水平低下，表现出Ⅰ型HAE。
c1INH的Ⅱ型变异为单一碱基变异，包括碱基替换或缺失[10~15]。
多数Ⅱ变异发生在C1INH的RCL上。编码RCL氨基酸顺序的密码子位于C1INH基因的外显子Ⅷ，当发生单一碱基对替代变异后，RCL上的氨基酸顺序发生变异，由于产生靶酶识别的异常或C1INH-靶酶中间复合物稳定性减弱，最终导致C1INH功能性异常，表现出HAE[10~14]。
在RCL上的变异中，多数变异发生在反应中心的P1（Arg444）上。编码Arg444的密码子CGC含有一个极易突变的CpG二聚核苷酸，当C被T替代后，反应中心的Arg444变异为Cys，发生了已被命名的Da、Ca、Fe的C1INH变异；当G被A替代后，反应中心的Arg444被His替代，发生了Ri、Sp型变异；At、Bo、Gu、Za等型的变异皆为类似的变异，Arg444分别被His、His、Leu、Ser、His替代[10~12]。当P1位的Arg发生替代变异后，C1INH发生了靶酶识别异常，C1-抑制功能异常。
ocejo-Vinyals等[13]报道了一个Ⅱ型HAE变异的西班牙家族，在该家庭中发现了P1’（Thr445）的替代变异。P1’是反应中心的另一靶酶识别位点；当编码Thr的密码子发生A→C的替代变异，Thr445被Cys所替代，变异后的C1INH由靶酶的抑制剂特性转变成为底物特性，导致血浆C1INH的靶酶抑制活性降低，引发Ⅱ型HAE。
在邻近反应中心P1（Arg444）的P10、P12、P14位的Ala(即肽链Ala436、Ala434、Ala432)亦是突变热点，对抑制剂-靶酶复合物的稳定性至关重要。当编码Ala的密码子突变，Ala被Glu替代，发生Ma型（Ala434→Glu）变异和We型（Ala432→Glu）变异；被Thr替代，发生Mo型(Ala436→Thr)变异和Ca型(Ala436→Thr)变异[14]。
ala443的替代变异发现于系统性红斑狼疮（Systemic lupus Erythematosus, SLE）而未出现HAE的家族。Ala443紧邻反应中心Arg444当它被Val替代后，大分子氨基酸的侧链基因影响到C1INH对靶酸的识别，C1INH对C1亚组分的抑制活性减弱，因而引发补体激活-抑制调节失衡的疾病SLE。但变异型C1INH对FⅩⅡa、激肽释放酶的抑制活性正常，在临床上未表现出HAE[11，12]。
ta型C1INH变异是迄今发现的唯一发生在RCL以外氨基酸缺失性变异。由于编码Lys251的密码子缺失，合成的Ta型C1INH的肽链结构缺少Lys251。因此Lys251相邻位置的氨基酸顺序由Asn-Lys-Ile-Ser变异成为Asn-Ile-Ser，产生了一个新的糖基化位点。Lys251位于F-α-螺旋与A-β-折叠之间，变异结构通过F-α-螺旋直接或间接地破坏了A-β-折叠结构，对形成蛋白酶-抑制剂稳定复合物产生了影响，导致酶抑制功能低下[15]。
3 C1INH缺乏相关性疾病
血管神经性水肿（Angioeurotic edema,AE）是因血浆中血管渗透活性增强所致，这与补体系统或接触系统的激活产生与血管渗透性有关的激肽类物质有关。C1INH作为补体组分C1唯一的抑制剂，FⅩⅡa的主要抑制剂，其缺乏将导致补体系统和/或接触系统活化的调节失衡，使激肽浓度增高，血管渗透性增强，从而表现出血管神经性水肿的临床症状，如体表水肿或粘膜水肿，全身性任何部位发生自限性血管性水肿。当发生粘膜水肿时，三分之二的病人出现突发性腹痛、腹胀、呕吐、不能排气等肠梗阻等表现。半数以上的病人有咽部水肿、吞咽困难、声嘶、憋气。约有80%的病人发生喉头水肿窒息而死亡[1，2]。
遗传性血管神经性水肿（Hereditary angioeurotic Edema,HAE）是一种常染色体遗传病，发病率约为五万分之一。85%的HAE病人属Ⅰ型，患者血浆中C1INH抗原含量降低并且酶抑制活性水平降低，约为正常人的30%，甚至更低。Ⅱ型HAE患者的血浆C1INH抗原含量正常或略高，但靶酶抑制活性异常或低下[1，9~15]。
获得性血管神经性水肿（Acquired angioneurotic Edema,AAE）是正常C1INH遗传个体，因某种特定病理生理过程引起C1INH消耗增加所致，其特征为C1INH、CH50、C1q、C1、C4以及C2水平均低下。与HAE不同的是，AAE病人的C1INH代谢正常或轻微的升高[16~23]。随着病理诊断学的发展，已根据诊断特征将AAE分为Ⅰ型和Ⅱ型两大类型。Ⅰ型AAE与淋巴细胞增生异常性疾病或其它恶性肿瘤如淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病等有关，尤其是淋巴瘤[17，18]。此类患者体内产生了针对独特型（Idiotype）抗原的抗体。抗体识别新生B-细胞的独特型抗原，形成独特型抗原-抗体复合物。这类抗原抗体复合物对C1的活化能力比其它类型的抗原-复合物对C1的活化能力强，过量的活化C-1导致C1INH的大量消耗，引发血浆C1INH水平低下，从而使补体激活途径和/或接触系统的活化调节失衡，引发AAE[1,16~18]。
donaldson等[19]发现了另一种类型的AAE病例（Ⅱ型）。患者血浆中产生了针对C1INH的自身抗体。他们从这类AAE患者发病期间的血浆中纯化出抗自身C1INH抗体并证明该抗体识别C1INH反应中心约8个氨基酸长度的抗原决定簇。C1INH反应中心与抗C1INH抗体结合后，C1INH不能与活化的C-1形成稳定的复合物，丧失抑制靶酶的活性，从而加快了在血浆中的消耗，使血浆中的C1INH酶解片段增加[19~23]。
4 C1INH在血管神经性水肿治疗中的应用
急性期、威胁生命的HAE或AAE已成功地采用C1INH制剂静脉输注，使血液C1INH的水平迅速得到提高，恢复对补体活化、接触系统活化的调节功能，以迅速控制HAE或AAE。自80年代初，C1INH浓缩制剂应用于临床以来，除1例长期使用C1INH浓缩制剂产生抗C1INH抗体外，未见有其它副作用的报道[24~26]。
1996年，Donaldson等[24]报道了用C1INH浓缩制剂治疗1例HAE伴SLE合并抗C1INH抗体的病例。患者每周接受2180IU的C1INH浓缩制剂的静脉输注治疗，患者的HAE伴SLE并发症得到良好的控制，在用C1INH浓缩制剂8个月后，患者产生了对C1INH的抗体，方停止使用C1INH。在此期间，患者一直未出现其他副作用，身体亦得到良好的恢复。
在对Ⅱ型AAE的C1INH的补充治疗过程中发现，C1INH静脉输注有加重AAE的现象。现代临床应用研究证明，当Ⅱ型AAE患者接受低剂量的C1INH的输注后，由于C1INH被抗C1INH抗体中和，产生了更多的抗原-抗体复合物，激活C1从而加快了C1INH的消耗，而C1INH的低剂量补充又不足以抑制补体激活途径，因而加重了Ⅱ型AAE病症。Ⅱ型AAE患者需要一次性接受更高剂量的C1INH的输注，才能克服患者血浆中抗C1INH抗体对C1INH的中和作用。Ⅱ型AAE患者所需适当剂量可通过体外测定血浆与C1INH形成抗原—抗体复合物的量来进行清除后，C1INH水平得到恢复，C1、C4水平相继得到提高。
早期的C1INH浓缩制剂具有一定的传播病毒性疾病的可能性，特别是C型肝炎的传播。随着病毒灭活方法的成熟并成功的组合到C1INH的生产工艺中，C1INH浓缩制剂的使用更加安全可靠[26]。
作者单位：610063成都生物制品研究所
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马海茸校对
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