急性粒-单核细胞白血病CBFβ-MYH11融合基因转录本和inv(16)的检测

中华血液学杂志 1998年第1期第19卷 论　　著

作者：何凯莉　顾柏炜　曹琪　苏欣莹　陈赛娟　陈竺

单位：200025　上海第二医科大学附属瑞金医院、上海血液学研究所

　　关键词： 白血病，粒-单核细胞性，急性；融合基因，CBFβ-MYH11；聚合酶链反应；荧光原位杂交

　　摘要　目的：探讨inv(16)和CBFβ-MYH11融合基因在急性髓系白血病M_4EO型的临床诊断、预后判断中的意义。方法：用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和荧光原位杂交(FISH)技术分别检测急性粒-单核细胞白血病(M₄)患者的CBFβ-MYH11融合基因转录本和inv(16)。结果：在15例中国人M₄中，10例患者用RT-PCR方法检测CBFβ-MYH11融合基因转录本，其中9例不伴异常嗜酸粒细胞的M₄中有1例阳性；1例伴异常嗜酸粒细胞增多(M_4EO)为阳性。随访该例完全缓解2个月后，其PCR仍持续阳性。用FISH技术检测的9例M₄中得到的2例阳性病例，与PCR方法测得的结果完全一致。结论：对M₄患者无论其经典的染色体核型分析有无16号染色体异常的提示，都应用RT-PCR和FISH方法检测CBFβ-MYH11融合基因进行筛选，这对M₄的临床诊断、预后判断等具有重要临床价值。

　　Detection of CBFβ-MYH11 fusion transcript and inv(16)(p13;q22) in acute myelomonocytic leukemia(M₄) by RT-PCR and FISH 　He Kaili,Gu Buowei,Cao Qi,et al.Shanghai Institute of Hematology,Shanghai Second Medical University,Shanghai　200025

　　Abstract　 Objective:To study the clinical significance of inv(16) and CBFβ-MYH11 fusion gene in the diagnosis and prognosis for M_4Eo.Methods:CBFβ-MYH11 fusion transcripts and inv (16) were analyzed by reverse-transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) and fluorescence in situ hybridization(FISH),respectively,in acute myelomonocytic leukemia(M₄) with or without eosinophilia.Results:In fifteen cases tested,one case of M_4Eo and one of 9 M₄ without eosinophilia were found to have CBFβ-MYH11 fusion transcript.Follow-up of the M_4Eo patient showed residual PCR positivity 2 months after complete remission.Conclusion:The data suggest that screening by both RT-PCR and FISH should be performed in all AML-M₄ regardless of morphologic features to allow accurate diagnosis and prognosis of M₄ patients.

　　Key words　Leukemia,myelomonocytic, acute　　Fusion gene,CBFβ-MYH11 　　Polymerase chain reaction　　Fluorescence in situ hybridization

　　急性髓细胞白血病(AML)中急性粒-单核细胞白血病(M₄)伴异常嗜酸粒细胞增多这一独特亚型被定名为AML-M_4EO，以往的诊断主要根据细胞形态学、组化以及嗜酸粒细胞比例^［1］。由于该亚型在M₄中预后较好，故提高检出率尤具临床意义。绝大部分M_4EO都提示有16号染色体结构异常，较为特异和常见的是16号染色体倒位，即inv(16)(p13;q22),但用传统的核型分析，特别是R带技术检出率较低。随着对16p和16q断裂点的克隆，已明确inv(16)累及的是16号染色体长臂的CBFβ基因和短臂的MYH11基因，倒位的结果形成CBFβ-MYH11融合基因^［2，3］。我们建立了半筑巢式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，用以检测该融合基因转录本，并联合运用荧光原位杂交(FISH)技术对受累基因的重排进行检测，为研究M_4EO白血病的发病机制、临床诊断及预后判断提供了特异的分子标志。

材料和方法

　　1　标本来源　15例患者样本由上海第二医科大学瑞金医院、仁济医院，上海市第一人民医院，上海医科大学中山医院提供，其中男10例，女5例，年龄为3～74岁。根据FAB标准分类法诊断，14例为M₄，1例为M_4EO，标本来自初发和完全缓解后2个月。

　　2　细胞遗传学　15例患者的骨髓和(或)外周血经短期培养(37℃，24小时)，用秋水仙素终止于有丝分裂中期，应用R带和(或)G带技术进行染色体显带分析，分析15个以上分裂中期细胞，核型分析根据染色体国际命名法(ISCN1991)。

　　3　半筑巢式RT-PCR检测CBFβ-MYH11转录本

　　3.1　RNA制备：应用一步法异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提细胞总RNA^［4］。

　　3.2　RT-PCR法：根据CBFβ-MYH11融合基因顺序，并参考文献［5，6］，设计了5个寡核苷酸引物和探针(模式图见图1)：逆转录反应引物A，第一步PCR反应引物B、C，第二步PCR反应引物D(3′端引物同C)，寡核苷酸探针E。其顺序如下：

　　A：CTCTTGTAGCTGCATGAGGTCTG

　　B：5′-GACGGCAAGGTATATTTGAAG-3′

　　C：5′-CTCTTCTCCTCATTCTGCTC-3′

　　D：5′-GGGCTGTCTGGAGTTTGATG-3′

　　E：AGGAAATGGAGGTCCATGAG

　　3.2.1　逆转录反应：在40μl总体系中进行，包括总RNA 1μg，逆转录引物100ng，500mmol/L dNTP，MMLV逆转录酶200U，于37℃孵育45分钟。

　　3.2.2　PCR反应：反应总体积为50μl，包括寡核苷酸引物0.3μmol/L,dNTP浓度各为200μmol/L,缓冲液浓度Tris-HCl 10mmol/L,pH8.4,MgCl₂ 1.5mmol/L,Taq聚合酶1.5U。扩增条件为94℃变性5分钟，94℃变性45秒，退火57℃1分钟，72℃延伸1分30秒，共30个周期，最后1周期延伸时间为72℃7分钟。第二步反应的模板为第一步反应产物100倍稀释后取10μl，退火温度59℃，共25个周期。每一反应均设阴性对照，包括非M₄ RNA标本和无RNA标本的空白对照。

　　3.2.3　PCR产物的检测：取10μl PCR产物，在1.6%琼脂糖凝胶进行电泳，用溴乙锭(0.5μg/L)染色，紫外灯下照相。

　　3.2.4　PCR产物的测序：取第二轮PCR产物5μl，加入exonucleasel和Shrimp alkaline phosphatase预处理。利用Sanger末端终止法原理，采用 Dye Terminnater标记法，在ABI377自动测序仪上，用4%聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳，电压1.68kV,电流50mA，约7小时。

　　4　FISH　从法国人类多态性研究中心(CEPH)的酵母人工染色体库筛选出的854E2克隆作为探针，它跨越16p13区域^［2］，经inter-Alu-PCR扩增后，将Biotin-21-dUTP以缺口平移法标记YACDNA探针，同时掺入³H-dATP以监测Biotin的掺入率约40%。原位杂交法：总杂交体系12μl，含90ng的YACDNA，1000×胎盘DNA(10mg/ml),50%甲酰胺，2×SSC，10%硫酸葡聚糖，pH8.0。将探针在72℃变性8分钟后，在37℃温育1小时进行预杂交。玻片在70%甲酰胺，2×SSC，pH7.0的变性液中70℃变性2分钟，并经70%，80%，90%，100%系列乙醇脱水。将预杂交后的探针加入玻片上，盖上盖玻片(22mm×22mm)，用胶封片，置湿盒中37℃杂交过夜。次日，将玻片在45℃的50%甲酰胺，2×SSC，pH7.0溶液中洗涤3次，每次3分钟；2×SSC(pH7.0)溶液中洗涤3次，每次2分钟；0.1×SSC洗涤2次，每次2分钟；BN溶液中洗涤1次。经Biotin标记的探针再用Avidin-FITC(5μg/ml),然后再用单抗Avidin抗体(10μg/ml)检测。最后染色体加碘化丙锭(0.8μg/ml)/抗淬灭剂染色。选择NikonUFX-DX荧光显微镜双色滤片组合B-2A进行观察，并通过染色体自动分析仪Cytovision进行图像摄取和分析。染色体R带显带法：用Hoechst 33258(100μg/ml)溶液染色15分钟，用水漂洗后将玻片浸于水中，置365nm紫外灯下照射20分钟，并于87.5℃的Earle液中加热3分钟后经42℃1×BN溶液浸泡1分钟，再置室温1×BN中。

A～D为寡核苷酸引物；E为寡核苷酸探针；nt495为CBFβ基因的断裂点；nt994，1201，1921为MYH11基因的断裂点

　　图1　用RT-PCR扩增CBFβ-MYH11融合基因的模式图及测序结果

结　　果

　　1　细胞遗传学　对15例M₄患者，包括1例M_4EO进行染色体分析，除1例M_4EO患者可见明显的16号染色体异常外，14例M₄中有1例亦可检测到inv(16)。

　　2　半筑巢式PCR技术的特异性　在10例受检的M₄患者中，2例细胞遗传学证实有inv(16)的患者均见分子量一致的扩增条带(322bp)并用直接测序的方法对第二轮PCR产物测序，证实为剪接转录本A型，证明此法对CBFβ-MYH11融合基因转录本的检测有高度特异性。

　　3　半筑巢式PCR技术的敏感性及其与DNA印迹法的比较　为探讨该法的灵敏度，我们对1例阳性患者进行敏感度测定，取其1μgRNA,以非M₄白血病患者RNA作为稀释剂进行1∶10～1∶10⁷连续稀释，再进行半筑巢式PCR反应。结果患者RNA稀释至1∶10⁴时，仍可见反应扩增带，反映了本法的敏感性(见图2)。

　　1～7表示将1μgRNA进行1∶10⁷至1∶10稀释；8为阳性病例12的RNA，未做稀释；9为阴性对照；

　　M为PGEM7zf(+)HaeⅢmarker

图2　RT-PCR检测转录本的敏感度测定(特异探针杂交结果)

　　4　FISH检测结果　9例受检的M₄患者中，有2例(M₄ 1例，M_4EO1例)在80%～90%的分裂相中，一条16号染色体可见到四个荧光信号，其中一对位于16号染色体的16p13区带，另一对位于16q22区带；另一条16号染色体在其短臂上有一对荧光信号。

　　15例M₄患者的细胞形态学、细胞遗传学、RT-PCR和FISH结果比较见附表。

讨　　论

　　inv(16)的结果是16号染色体长臂的CBFβ基因与短臂的MYH11基因发生重排，产生CBFβ-MYH11融合基因。CBFβ链不直接结合DNA，而是通过与CBFα形成异二聚体来增加α链与DNA结合的亲和力，稳定该异二聚体的稳定性。目前已识别了一些CBF结合位点，它们存在于TCR、GM-CSF、GM-CSF受体、髓过氧化物酶及中性粒细胞弹性蛋白基因的调控区，因此可能是由这些基因的表达失控而致白血病。CBFβ-MYH11嵌合蛋白如何诱导粒系转化尚不清楚，研究提示它保持了与CBFα(AML1)相互作用的能力，因此可能是在正常情况下由CBFα调节的目的基因上的转录复合体发生活性改变而引起粒系转化。随着研究的进一步深入，CBFβ-MYH11融合基因在M_4EO的致病的重要作用将日益明了。

附表　M₄患者临床资料、PCR、FISH检测结果

　　研究结果提示，CBFβ基因断裂点恒定地位于3′端编码区的17个氨基酸处(nt495)，而MYH11基因的断裂点存在5种不同方式，因此根据MYH11断裂点的不同，CBFβ-MYH11转录本有5种不同的剪接方式，但最常见的为A型(即MYH11基因的断裂点在于nt1921)，占80%^［5］，其余均少见。我们应用的半筑巢式PCR反应检测到的2例阳性患者均为A型，在以后的研究中，有必要设计针对其它断裂点的引物，以期发现其它的剪接转录本类型。

　　该方法所需标本量少(1μgRNA)，其敏感度达到可检测100pg白血病细胞RNA，但实际仅用1/4逆转录反应产物、1/100第一轮PCR产物分别作为第一轮和第二轮PCR反应模板，1/5的扩增产物进行分析。所以，扩增条带的产生实际来自0.05pg白血病细胞总RNA。据推算，我们可在2×10⁵个正常细胞中检测到1个携带CBFβ-MYH11融合基因的白血病细胞，由此可见本法的敏感度之高。

　　我们在1例不伴异常嗜酸粒细胞的M₄患者体内检测到转录本，提示用RT-PCR和FISH技术筛选M₄患者有助于对这些病例的精确诊断和预后评估。

　　我们在1例M_4EO患者中检测到转录本和inv(16)，这与国外文献报道相一致，但inv(16)在M_4EO中的发生率至今仍不肯定。Larson等^［6］调查了M_4EO患者33例，发现27例伴inv(16)，6例伴t(16;16)。Campbell等^［7］从反方向研究细胞遗传学与血液学间的联系，他们报道了26例伴inv(16)(p13;q22)或t(16;16)(p13;q22)的病例，16例为M_4EO，其余10例为M₂、M₄、M₅、骨髓增生异常综合征，而这10例中6例伴嗜酸粒细胞增多。现认为，inv(16)是M_4EO特征性的异常核型，它所形成的CBFβ-MYH11融合基因可作为M_4EO的分子生物学标志。

　　我们跟踪了1例M_4EO伴inv(16)完全缓解约2个月的患者，PCR检测仍呈阳性，说明RT-PCR为微量残留病(MRD)检测的优选方法，对该例患者的进一步随访有助于MRD的监测。FISH技术是近年来发展起来的新技术，它的优点在于可对单个细胞进行基因的诊断和残留白血病细胞检测。我们在中期分裂细胞检测到携有inv(16)的病变细胞，而且适当的探针(如YACDNA探针长达数百kb)不受融合基因异质性的影响。复发早期患者，其体内残留的白血病细胞正处于分裂增殖的旺盛期，此时FISH可直接观察到增殖期的白血病细胞，能更直接地反映病情状况，及时预报复发。对未分裂细胞，FISH能在短时间内对大量间期核进行快速检测。将RT-PCR与FISH技术相结合，将对疗效监测、预后判断都有实际临床应用价值。

参 考 文 献

　　1　Bloomfield CD,Arthur DC.Del(16)(q21 or 22)and eosinophilia in acute nonlymphocytic leukemia(ANLL):a new cytogenetic-clinical association.Proc Am Soc Clin Oncol,1982,38:191.

　　2　Liu P,Terle SA,Claxlon DF,et al.Fusion between transcription factor CBFβ/PEBP2β and a myosin heavy chain in acute myeloid leukemia.Science,1993,261:1041-1044.

　　3　Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156-159.

　　4　Poirel H,Radford-Weiss I,Kalrina R,et al.Detection of the chromosome 16 CBFβ-MYH11 fusion transcript in myelomonocytic leukemia.Blood,1995,85:1313-1322.

　　5　van der Reijden BA,Lombardo M,Dauwerse HG,et al.RT-PCR diagnosis of patients with acute nonlymphocytic leukemia and inv(16)(p13;q22) and identification of new alternative splicing in CBFβ-MYH11 transcripts.Blood,1995,86:277-282.

　　6　Larson RA,Williams SF,le Bean MM,et al.Acute myelomonocytic leukemia with abnormal eosinophils and inv(16) or t(16;16) has a favorable prognosis.Blood,1986,68:1242-1249.

　　7　Campbell LJ,Challis J,Fok T,et al.Chromosome 16 abnormalities associated with myeloid malignancies.Genes Chrom Cancer,1991,3:55-61.

(收稿：1997-03-31)

(校对：张志方)