急性髓系白血病细胞p16基因结构及转录水平表达

中华血液学杂志 1998年第1期第19卷 论　　著

作者：刘文励　周剑锋　肖侃艳　唐锦治

单位：430030　武汉,同济医科大学附属同济医院

　　关键词： 基因,p16；白血病,髓样,急性；细胞周期

　　摘要　目的:了解p16基因在急性髓系白血病(AML)发病中的意义。方法:用聚合酶链反应-单链DNA构象多态性、Northern blot方法分析16例AML细胞p16基因结构及转录水平表达。结果:16例均无p16基因的缺失、突变。初治和复发的12例AML的p16 mRNA表达水平明显低于4例长期缓解者及正常对照。1例p53基因突变AML的p16 mRNA有明显升高。结论:p16基因在AML发病中可能不占重要地位,而在AML病态造血的维持中起一定作用,在p53突变时其表达反馈性升高,显示一种反馈环路失衡,提示在研究单个基因的基础上观察细胞周期检测点功能具有重要意义。

　　The structure and mRNA expression of p16 gene in AML cells 　　Liu Wenli,Zhou Jianfeng,Xiao Kanyan,et al.Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan,430030

　　Abstract　Objective：To explore the role of p16 gene in the pathogenesis of AML.Methods：PCR-SSCP and Northern blot were used to analyse the structure and mRNA expression of p16 gene in 16 cases of AML.Results：No deletion or mutation of p16 gene were found in all of the 16 cases.The p16 mRNA expression in 12 AML at diagnosis or relapse was significantly lower than that in 4 long term remission cases and normal controls.p16 mRNA expression was significantly higher in a case of AML with p53 mutation.Conclusion：p16 gene may not play an important role in the pathogenesis of AML.The high p16 expression in the patient with p53 mutation might reflect a kind of inbalance of the feedback cycle.

　　Key words　 Gene，p16　　Leukemia,myeloid,acute　　Cell cycle

　　p16基因是重要的抑癌基因,位于染色体9p21。p16蛋白抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4和6,是细胞G₁/S期转换的关键调控基因。目前国内外对p16基因的分析偏重于基因结构,而对其功能的观察尚少,为此,我们应用聚合酶链反应-单链DNA构象多态性(PCR-SSCP)、Northern blot等技术,观察了原代急性髓系白血病(AML)细胞p16基因结构和功能活性的变化。

材料和方法

　　1　病例　16例AML均经细胞形态学、免疫学分型确诊,FAB分型M₀ 1例、M₂ 8例、M₃ 2例、M₄ 3例、M₅ 2例。其中初治7例,复发4例,MDS转M₂ 1例，长期存活持续完全缓解(CCR)5年以上病例4例。年龄15～58岁。全部标本均于化疗前(长期缓解病例在每次巩固治疗前)采取,未治和复发的12例患者原始+早幼粒细胞＞0.90,分离其单个核细胞。除1例外显子6 p53基因突变(M-p53)外,均为野生型p53(wt-p53)。正常骨髓对照采自志愿献髓者。

　　2　主要试剂　尼龙膜、trizol总RNA提取试剂盒、缺口平移标记系统、sephadex G-75、Taq酶购自Gibco公司;α-³²P-dCTP购自北京亚辉公司;PGRE5-p16质粒探针由美国冷泉港实验室Beach博士惠赠;β-actin探针购自华美公司。

　　3　检测方法

　　3.1　PCR-SSCP:p16外显子2引物5? CTGACCATTCTGTTCTCTCTGGCA 3?,5?CATGGTTACTGCCTCTGTTGC 3?(北京赛白盛公司合成),扩增产物303bp,包括突变热点区在内^［1］。扩增体系:10×PCR缓冲液5μl,10mmol/L dNTP 1μl,25μmol/L引物各0.5μl,Taq酶0.5μl(2.5U),甲酰胺2μl,50mmol/L MgCl₂ 3μl,模板DNA0.1μg,加高纯度水至50μl,覆以等量矿物油,94℃变性5分钟,94℃30秒,55℃30秒,72℃30秒热循环30次,72℃延伸3分钟,取扩增产物10μl,经NaOH0.5mol/L 2ml,10mmol/L EDTA 2μl,40℃变性10分钟后置4℃,经含5%甘油,6%PAGE分离，取凝胶银染后拍照。

　　3.2　Northern blot:异硫氰酸胍一步法提取总RNA,20μg总RNA于1%甲醛变性胶电泳分离,快速倒转法将RNA转至尼龙膜后,置真空干燥器保存待用。EcoRⅠ　HindⅢ酶切PGRE5-p16质粒,电泳分离回收960bp的p16 cDNA探针,用缺口平移法标记α-³²P-dCTP sephadex G75过柱纯化,在50%甲酰胺5×SSC,1%SDS,5×Denhart’s液,20%葡聚糖,100μg/ml ss DNA体系42℃恒温水浴中预杂交4小时后,加纯化的p16标记探针0.5μg,在42℃恒温水浴摇床杂交20小时,取膜依次于2×SSC、0.5%SDS、1×SSC中洗涤,终洗膜条件为1×SSC,1%SDS于60℃洗15分钟左右,同时用监测器监测非特异性信号到极弱为止。略干后,置带增感屏的曝光盒于-70℃放射自显影2周后冲片,并于1mmol/L Tris-Cl,1mmol/L EDTA(pH 8.0),0.1×Denhart’s溶液中75℃2小时去探针,并与β-actin探针重复杂交,步骤同上。

　　3.3　图像及数据处理:放射自显影图像经岛津CS-910薄层层析扫描仪分析mRNA的表达水平,以正常对照为1.0,求出各例p16、β-actin mRNA的相对水平,p16 mRNA的最终水平须用β-actin 作为内参校正,以去除实验误差。数据以±s表示,用t检验。

结　　果

　　1　p16基因的缺失、突变分析　经PCR扩增16例AML均扩增出303bp长的产物,图1为扩增产物的部分琼脂糖凝胶电泳检测结果。图2为扩增产物经SSCP分析的部分结果,与正常对照相比,未出现异常迁移带,结果表明p16基因的缺失、突变在本组AML中均不存在。

　　2　p16基因的表达分析　如图3所示,同CCR组及正常对照的p16 mRNA平均水平(1.75±0.44)比较,初治和复发AML的表达水平较低(0.30±0.26),差异有显著意义(P＜0.01)。但泳道13 AML的p16 mRNA表达亦增高,此例为p53突变病例。

1～6为AML;7为正常对照;8为阳性对照(无模板DNA);　M为分子量标准(λ/HindⅢ+EcoRⅠ)

图1　p16基因的缺失分析

1～4为AML;N为正常对照,未见异常迁移带,均为野生型p16

图2　p16基因PCR-SSCP分析

　　N为正常对照;1～4为长期CR病例;5～16为AML初治和复发病例;13为AML患者p53基因突变型;　　图下数据分别为p16 mRNA和β-actin表达水平

图3　Northern blot分析p16 mRNA表达

讨　　论

　　Kamb等^［1］对290余种肿瘤细胞系p16基因检测结果表明,约50%肿瘤细胞系显示p16基因的纯合子缺失,并认为在肿瘤发病中,其异常率可能超过p53,在急性白血病细胞系中p16基因纯合子缺失率为25%。但在原代急性白血病细胞p16基因缺失、突变率较低,为4/72^［2］。考虑到突变主要发生在p16外显子2,且外显子2可反映p16基因缺失与否^［1］。我们对外显子2进行PCR-SSCP分析，在12例初治和复发及4例CCR的AML中均未检出p16基因外显子2、纯合子缺失和突变,与国外的报告相符^［2］。12例初治和复发病例选择原始幼稚细胞比例均＞0.90,而且所用的模板量低至0.1μg,污染的可能性极小。既往在AML细胞系发现有较高的p16基因缺失、突变率^［3］,此差异可能是体外培养传代中发生的继发性变化。Hebert等^［4］报告p16基因缺失、突变在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)检出率最高,达22/24。前B细胞白血病p16基因缺失检出率为11/53^［5］。因此,在AML中p16基因缺失结构鲜有改变的现象可能提示在造血系统恶性肿瘤的发生和演变中因细胞来源差异,p16具有不同的作用。近年有文献报告,在AML中p16的同源基因p15功能灭活率高达86%^［6］,提示不同起源的恶性肿瘤其关键的基因突变及积累存在较大的差异。

　　对p16转录水平的分析表明,初治和复发AML其骨髓细胞p16表达活性明显低于正常对照和处于长期缓解AML的骨髓细胞,提示p16基因的转录活性水平变化在AML的病态造血的维持中起一定的作用。1例p53突变病例p16 mRNA水平增高,其机制可能是p53灭活后CDK₄活性的增强,反馈性地上调p16表达^［7］。提示p16基因的灭活存在多种途径。Sherr^［8］认为,Cyclin D、CDK₄、Rb等基因的灭活均可有类似p16基因灭活的效应,提示在研究单个基因的基础上,观察细胞周期检测点功能对阐明肿瘤发病机制,制定肿瘤的个体化治疗更有意义。

参 考 文 献

　　1　Kamb A,Gruis NA,Feldhaus JW,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Sciense,1994,264:436-438.

　　2　Hirama T,Koeffler HP.Role of the cyclin-dependent kinase inhibitors in the development of cancer.Blood,1995,86:841-854.

　　3　Nobori T,Miura K,Wu DJ,et al.Deletion of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers.Nature,1994,368:753-756.

　　4　Hebert J,Cayuela JM,Berkeley J,et al.Candidate tumor-suppressor genes MTSI(P₁₆^INK4A) and MTSZ(P₁₅^INK4B) display frequent homozygous deletions in primary cells from T-but not from B-cell lineage acute lymphoblastic leukemias.Blood,1994,84:4038-4044.

　　5　Stranks BG,Height SE,Mitchell P,et al. Deletions and rearrangement of CDKN₂ in lymphoid malignancy.Blood,1995,85:893-901.

　　6　Herman JG,Jen J,Merlo A,et al.Hypermethylation-associated inactivation indicates a tumor suppressor role for P₁₅^INK4B1.Blood,1995,86(suppl):316-317.

　　7　Tam SW,Shay JW,Pageno M.Differential expression and cell cycle regulation of the cyclin-dependent kinase 4 inhibits P₁₆^INK4.Cancer Res,1994,54:5816-5820.

　　8　Sherr CJ.Cancer cell cycle.Science,1996,274:1672.

(收稿:1997-01-21　　修回:1997-07-11)

(校对:徐丽娟)