慢性病毒性肝炎的基因治疗

　　[选定] 传染病学, 分子生物学, 微生物学

国外医学内科分册1998年第25卷第10期

上海第二医科大学附属新华医院（200092）展玉涛 综述 李定国 审校

　　摘要　本文综述了近年来有关反义寡核苷酸、核酶、显性失活突变、DNA疫苗等基因治疗技术治疗慢性病毒性肝炎的国外研究新进展。

　　关键词 慢性病毒性肝炎；基因治疗；反义寡核苷酸； 核酶； 显性失活突变； DNA疫苗

　　慢性病毒性肝炎主要包括慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎，是危害人类健康的常见病、多发病。目前已经证实的唯一有效治疗方法是α-干扰素治疗，但其对慢性乙型肝炎的有效率为25%-40%，对慢性丙型肝炎的有效率仅为10%-25%^[1]。分子生物学的发展和应用使基因治疗成为探索治疗慢性病毒肝炎的新途径。根据基因学，人类疾病可分为下面3种主要类型：①单基因疾病，即由单基因缺陷引起且符合经典孟德尔法则的遗传病；②多基因疾病，即与几个基因突变有关的疾病；③获得性基因改变的肿瘤疾病^[2-4]。根据这种基因学分类，基因治疗包括：①治疗单基因疾病的替换疗法；②治疗多基因疾病的添加基因疗法；③治疗获得性基因疾病的阻断基因表达或功能疗法；④治疗多基因疾病及获得性基因疾病的DNA疫苗疗法。慢性病毒性肝炎系感染性疾病，因此其基因治疗包括阻断基因表达的功能以及DNA疫苗疗法。

　　阻断基因表达或功能

　　这主要包括诱饵、转录、核酶、干扰肽或蛋白质合成（如显性失活突变）以及反义策略（如反义寡核苷酸）等，其中反义寡核苷酸、核酶及显性失活突变研究较多^［５］。

　　反义寡核苷酸　反义寡核苷酸与RNA结合形成RNA-RNA杂交从而抑制RNA复制、逆转录或信使RNA翻译。反义寡核苷酸已被成功地用于治疗HBV或HCV感染。Xie等^[6]研究了反义寡核苷酸对HBV的抑制作用，结果发现针对S基因起始区的反义寡核苷酸能显著地抑制HBsAg的产生，针对C基因区反义寡核苷酸能抑制HBV病毒颗粒的产生、细胞内HBsAg水平及HBV dNA复制中间体。Moriya等^[7]研究发现针对X基因起始区的反义寡核苷酸能特异性地抑制X基因表达。Wu等^[8]也证实了反义寡核苷酸对HBsAg的抑制作用。Wakita等^[9]发现针对C基因起始密码子下游区域的反义寡核苷酸能特异性地阻断HCV的翻译并呈剂量依赖性。Alt等^[10]也发现对C基因起始密码子区326-348 nt及5'NCK 264-282 nt的反义寡核苷酸能明显抑制HCV复制，浓度为0.3μmol/L时抑制率分别为94.07%及96.04%。Hanecak等^[11]以互补于5'NCR翻译启动密码子及核心蛋白的编码序列的50种反义寡核苷酸对HCV基因表达的抑制作用，结果发现针对HCV内核酶进入部位的5'NCR内茎-环的反义寡核苷酸ISIS6095以及针对HCV多蛋白翻译启动序列跨越AUG的反义寡核苷酸ISIS6547对抑制HCV基因表达最有效并呈浓度依赖性，浓度为0.1-0.2μM时抑制率为50%。尽管针对HBV、HCV基因组的反义寡核苷酸已显示了抗病毒作用，但是还未找出能够完全根除病毒感染的最佳反义寡核苷酸。

　　核酶　核酶也称核苷酸酶，它的重要作用之一是催化RNA特殊序列切割、断裂反应。一些研究表明核酶能特异性地抑制切割HBV或HCV RNA^[12]。锤头状核酶由小的催化核区及5正链、3负链侧翼双螺旋区构成，是切割作用最强的核酶，HBV衣壳化信号（encapsidation signal）即一种茎-环结构，在HBV前基因组包装及转录中起关键作用。体外研究表明，锤头状核酶在衣壳化信号内具有明显的切割作用^[13]。Lieber等^[14]研究了作用靶点分别为HCV正链和负链的325、463、393、707和342、401的6种锤头状核酶Rz1、Rz 5、Rz 4、Rz6、Rz 2、Rz 3对HCV RNA表达的影响，结果表明6种锤头状核酶均能抑制动物肝细胞的HCV rNA以及慢性肝炎患者细胞中HCV RNA的表达。Sakamoto等^[15]设计了作用切割核苷酸位点分别为136-160、313-337、496-520及373-388的4种核酶Rz1-Rz 4，实验表明4种核酶均能在期望的位点发挥切割作用，Rz 2、Rz 4显著地抑制NCRC△Lue(NCR：非编码区C△：核心区Luc：虫荧光素酶)RNA翻译，抑制率分别为71%和49%，将Rz2、Rz 4分别与NCRC-LucRNA同时转染细胞后，Rz 2、Rz 4对NCRC-LucRNA表达的抑制率分别为72%和56%。

　　显性失活突变（dominant negative mutation）

　　显性失活突变是指能抑制细胞内野生型基因产生的突变，这种突变的表现型在野生型基因中是明显的，且能抑制野生型基因功能失活^[16]。显性失活突变能显著地抑制病毒复制。Scaglioni等^[17]发现通过病毒载体转移肝细胞内的HBV及Wookuck肝炎病毒显性失活突变能抑制野生型病毒的复制，因此认为显性失活突变可能成为基因治疗肝炎病毒的一种有效手段。显性失活突变与核酶、反义寡核苷酸相比，其优点是显性失活突变不依赖病毒序列且能将“治疗逃逸”突变的危险性降到最低水平。

　　DNA疫苗

　　DNA疫苗含有编码病毒蛋白（如核心蛋白、包膜蛋白）的基因，宿主细胞摄取外源性DNA并表达病毒基因、产生相应的病毒蛋白，后者通过宿主细胞的主要组织相容性复合体Ⅰ类（MHC-Ⅰ）途径被运载到细胞表面，通过刺激细胞表面的CD8及细胞毒性T细胞启动细胞介导的免疫反应，从而发挥抗病毒作用。HCV的DNA疫苗制备主要集中在能刺激保护性抗体产生的包被蛋白以及能诱导细胞毒性T淋巴细胞的核心蛋白或NS5肽^[18]。Tedeschi等^[19]给BALB/C鼠肌肉注射编码E₂序列基因的质粒DNA，结果发现12只鼠中10只鼠体内产生了E₂抗体。Saito将编码核心蛋白（pC）、E₁蛋白（pE₁）、E₂蛋白（pE₂）、核心蛋白E₁、E₂（pCE₁E₂）、E₁和E₂蛋白（pE₁E₂）、E₂结构N-端高变区（pE₂△HVR）的质粒转染到哺乳类动物细胞以及接种于鼠，发现6种DNA质粒在细胞内均能表达特异性的抗原，但有编码核心蛋白的质粒能导致特异性的细胞毒性T淋巴细胞反应^[20]。Chow等^[21]研究了编码HBV的S₂、S蛋白（pS₂-S）;S₂、S/IL-2蛋白（pS₂-S-IL-2）;S₂、S/IL-2蛋白（pS₂-S-IL-2）的DNA质粒对anti-HB-sAg产生、淋巴细胞增殖以及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4产生的影响，将剂量为100μg的上述质粒C57 BL/6鼠肌肉注射，8周后3组鼠体内均出现anti-HB-sAg；以剂量不同的pS₂-S、（pS₂-S-IL-2）及（pS₂-S-IL-2）质粒作用于鼠淋巴细胞，三组质粒均能促进淋巴细胞增殖且呈剂量依赖性，尤以（pS₂-S-IL-2）及（pS₂-S-IL-2）质粒的作用更为显著；三组质粒均能促进淋巴细胞产生IFN、IL-2及IL-4，其中pS₂-S质粒的这种作用最强，pS₂-S-IL-2质粒对淋巴细胞产生IL-4的作用最轻，pS₂-S-IL-2质粒对淋巴细胞产生IL-2及IFN的作用最强。结果提示共同表达HbsAg抗原和IL-2的DNA疫苗可能会发挥更好的抗病毒效果。

　　结语

　　从基因学角度来说，慢性病毒性肝炎属获得性基因疾病，其基因治疗包括阻断基因表达或功能以及DNA疫苗疗法。阻断基因表达或功能主要包括反义寡核苷酸、核酶、显性失活突变等，实验研究证明了这些治疗技术对慢性病毒肝炎的作用。但也存在一些问题，如增加核苷酸的稳定性、减轻其毒副作用、提高基因治疗对靶基因的特异性等等。我们相信随着分子生物学技术的发展，这些问题会逐步解决，基因治疗将为慢性病毒性肝炎患者带来福音。

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校对：张剑 1999年12月2日