镰刀菌毒素与黄曲霉毒素的联合毒性研究--AFB₁和DON的RDS实验

　　卫生研究2000年第29卷第6期

李斌　郭红卫

　　摘 要：为了解黄曲霉毒素(AFB₁)与镰刀菌毒素的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对DNA损伤修复的影响，用化学物质诱导的细胞增殖的变化实验，(replicative dNA synthesis, RDS)实验进行研究。结果表明：AFB₁和DON均可诱导细胞分化的S期DNA的合成，并且二者间存在交互作用。结果提示：AFB₁与DON在肿瘤的发生中既以遗传毒性物质的形式发挥作用，又以非遗传毒性物质的形式共同发挥作用。

　　关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇；黄曲霉毒素；联合毒性

　　RDS实验(replicative DNA synthesis)可反映细胞合成量的改变，是反映非基因毒性致癌物(nongenotoxic carcinogen)的良好指标。有人报道，RDS可测定80%Ames实验为阴性的非基因致癌物质^［1］。在遗传毒性研究中，RDS实验可作为未排定的DNA合成(unscheduled dNA synthesis,UDS)实验的良好补充。

　　由于黄曲霉毒素与单端孢霉烯族毒素共同污染粮谷类的现象非常普遍^［2，3］。当霉菌毒素进入机体后，其作用可能相互影响，它们之间可能具有交互作用，应当引起人们的足够重视。研究表明霉变的粮食中含有致突变、促癌和致癌物，可能是肿瘤高发的原因之一^［4］。为此，本文采用RDS实验对黄曲霉毒素B₁(AFB₁)与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的联合遗传毒性进行了研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　仪器及试剂

　　Beckman LS 6500液体闪烁计数仪；多头细胞收集仪；大鼠离体肝脏灌流装置(由超级恒温器、灌流仪、恒流泵3部分组成)；放射性同位素³H-TdR；混合气体(95%O₂，5%CO₂)；台盼蓝试液。

　　1.2　闪烁液

　　2，5-二苯基恶唑(PPO)4g，1，4-双-2-15-苯基恶唑苯(POPOP)0.4g，溶于1000ml二甲苯中。

　　1.3　Hank's液

　　NaCl 8.00g,KCl 0.40g，KH₂PO₄ 0.06g,NaHCO₃0.35g，MgSO₄^．7H₂O0.20g,CaCl₂^．2H₂O 0.154g,Na₂HPO₄^．12H₂O0.134g,葡萄糖 1.00g，酚红 0.02g，加蒸馏水至1000ml，调pH值至7.4^［5］。

　　1.4　灌流液

　　由缓冲液A、B、C 3部分组成，其组成成分如下：

　　Buffer A为改良的Hank's液加0.5mmol/L乙二醇双醚四乙酸(EGTA)；Buffer b为含0.05%Ⅳ型胶原酶(Sigma产品)及4mmol/L Ca²⁺的改良Hank's液；Buffer c为含1%牛血清白蛋白的Kerbs-Henseleit Buffer。以上缓冲液的pH值均调整到7.4，37℃恒温水浴预热。

　　1.5　正交表的确定和实验浓度

　　选用L₉(3⁴)正交设计表。以AFB₁和DON对动物的LD₅₀及细胞毒性，分别确定AFB₁和DON的第一作用水平为1.0μg/ml，以此剂量连续稀释10倍，分别得到第二(0.1μg/ml)及第三(0.01μg/ml)作用水平剂量的浓度。

　　1.6　RDS实验步骤

　　1.6.1　灌流分离肝细胞　选用SD雄性大鼠，体重180～250g，(上海医科大学实验动物部提供)。乙醚吸入麻醉大鼠，中腹切口，打开腹腔，将200U肝素注入下腔静脉，夹住门静脉，近肝侧45°切口、插管、结扎；用Buffer a 50ml先充盈肝脏，剪断下腔静脉，小心分离肝脏，摘下并放入37℃生理盐水，洗去血凝块，放入37℃灌流仪以100ml buffer A灌流4min，以洗去肝中残血，然后用含胶原酶的Buffer B灌流20min，流速为40～50ml/min，使肝脏外观呈黄色，肿胀，疏松；以不含酶的Buffer c 40～50ml冲洗灌流肝脏，以洗去其内的胶原酶。将肝脏浸入50ml buffer C中，剪去被膜，使肝细胞松散解离，用多层纱布过滤以除去结缔组织，滤液以500r/min离心2min，用Hank's液洗涤3次以除去残留的胶原酶，获得肝细胞，用台盼蓝实验得存活率大于90%，计数肝细胞浓度，用DMEM(含5%小牛血清，0.2%白蛋白)稀释至1×10⁵个/ml的肝细胞悬液。

　　1.6.2　CPM值的测定　将毒素溶解于甲醇中，取1ml于5ml试管中，以氮气吹干，然后将1×10⁵个/ml的肝细胞悬液分装其中，使其终浓度为实验浓度，每个浓度分3个平行样品，以不加毒素的正常细胞悬液作为阴性对照，阳性对照为苯巴比妥钠液(100μg/ml)。每管加³H-TdR185Bq/ml，37℃恒温水浴培养3h，然后用2ml冰生理盐水终止反应，用多头细胞收集仪收集细胞至滤膜上，用蒸馏水抽洗2次，依次用5%三氯醋酸固定，75%乙醇洗涤，100%乙醇脱水，烘干后，将纸片放入液闪杯中，加入0.5ml闪烁液，用Beckman lS 6500液体闪烁计数仪测定放射性CPM值。

　　1.7　结果判断依据

　　将CPM值进行平方根转换后作Dunnett t检验以判断结果，当实验组与阴性对照组的CPM值比较差异有显著性(P＜0.05)或有非常显著性(P＜0.01)时，判断为阳性。并根据下式求出DNA的放射比活性R值：

　　正交实验设计方差分析按文献进行^［6］。

　　2　结果

　　由表1、2可见，AFB₁和DON单独及交互作用对RDS实验的CPM值的影响有统计意义。AFB₁对DNA诱导的单独作用水平依次为第二作用水平＞第三作用水平＞第一作用水平。3个作用水平的CPM值均高于阴性对照(P＜0.01)。DON对DNA诱导的单独作用水平依次为第一作用水平＞第三作用水平＞第二作用水平。3个作用水平的CPM值均高于阴性对照(P＜0.001)。AFB₁和DON联合的诱导作用以AFB₁为第二作用水平、DON为第一作用水平时为最高；AFB₁为第一作用水平、DON为第三作用水平时为最低。通过对AFB₁和DON的RDS测试，发现AFB₁和DON可单独和联合诱导S期DNA的合成。

表1　AFB₁和DON的RDS实验结果

表2　AFB₁和DON联合作用时的CPM值

　　3　讨论　　RDS实验可反应细胞合成量的改变，是反应非基因毒性致癌物的良好指标。当DNA受外来物损伤时，细胞S期合成过程出现错误时，即可引起基因突变。根据此原理可在DNA水平上检测化学物质的损伤作用。有人报道，RDS可测定80%Ames实验为阴性的非基因致癌物质^［1］，表明两者具有很好的相关性。研究表明在遗传毒性研究中，RDS实验可作为UDS实验的良好补充。

　　利用哺乳动物细胞实验是检测化学致癌物不可缺少的一部分，并在危险性评价中起着很重要的作用。大鼠肝细胞取材方便，成活率高。大鼠肝细胞本身的S期DNA合成水平很低，而且肝细胞又含有代谢所需要的大部分促进活化的广谱酶系，本身含S₉活化系统，较接近体内的环境，是活化、吸收、分解毒物的重要代谢细胞。

　　致癌过程的体细胞突变理论，最早是由Bauer提出^［7］。致突变与致癌性之间具有良好的相关性。肿瘤细胞的形成主要由于正常细胞发生基因及外基因的改变而引起。癌基因的激活可以是基因水平的，也可是外基因水平或两者兼而有之，其结果是造成基因定量或定位上的差别，从而使正常的表型转化为癌细胞表型。另一方面，抑制癌瘤发生的抑癌基因由于某种原因功能丧失，使细胞癌变失去控制，如P53基因、rb-1基因^［8～10］。肿瘤发生的过程是多阶段、多因素、多途径总和作用的结果，肿瘤发生的每一步都反应出不同基因的丧失、激活和突变^［11］。

　　肿瘤的发生过程相当复杂，多半不是由单一的环境因素所决定，而可能是多种因素相互作用或共同作用的结果。1984年Upton/Weisburger和Williams分别提出按外源性化学物质致癌的可能机理将化学物分为3类，即遗传毒性致癌物(genotoxic)、可能的间接遗传毒性致癌物(indirectly genotoxic)、以及非遗传毒性致癌物(non-genotoxic)。本次研究发现AFB₁与DON具有致突变、诱导S期合成作用，同时两者还具有交互作用。其原因可能是AFB₁与DON在肿瘤的发生中既以遗传毒性物质的形式发挥作用，又以非遗传毒性物质的形式在肿瘤的发生中共同发挥作用。有研究表明，在霉变的粮食中含有促进AFB₁致突变和/或致癌的物质。由于致癌性与致突变性之间高度相关^{［12，13］}，这种协同效应的存在可能是增加居民患肿瘤的危险因素之一。故对霉菌毒素间的交互作用问题应引起重视。

　　作者简介：刘晓清，女，主治医师，硕士生

　　1 中国预防医学科学院环境卫生监测所

　　2 北京结核病防治研究所内科

　　作者简介：李斌，男，硕士，助教李斌（上海医科大学营养与食品卫生学教研室，上海　200032）　郭红卫（上海医科大学营养与食品卫生学教研室，上海　200032）

　　4　参考文献

　　1，Uno Y, Takasawa H, Miyagawa M, et al. An in vivo-in vitro replicativ e DNA synthesis(RDS) test using rat hepatocytes as an early prediction assay for nongenotoxic hepatocarcinogens screening of 22 known positives and 25 noncarcinogens. Mut Res,1994,320:189

　　2，Wang DS, Liang YX, Chan NT, et al. Natural co-occurrence of Fusarium toxins and aflatoxin B1 in corn for feed in north vietnam. Natural Toxins,1995,396:145

　　3，Akihiro Y, Yoshizawa T, Aiura Y, et al. Fusarim mycotoxin (fumonisins, nivalenol and zearalenol) and Aflatoxin in corn from southeast Asia. Bios Biot bioc,1995,59(9):1804

　　4，广西医学院肿瘤研究小组.肝癌高发区食物的诱癌实验.肿瘤防治研究，1975，2：13

　　5，上海医科大学医学遗传研究室.体细胞培养技术.上海：上海医科大学出版社，1989，60

　　6，金丕焕主编.医学统计方法.上海：上海医科大学出版社，1993，85

　　7，Burdette WJ. The significance of mutation in relation to the origin of tumors:a review. Cancer Res,1955,15:201

　　8，江希明，郑树，丁仁瑞主编.肿瘤生物学.杭州：浙江科学技术出版社，1990，7

　　9，朱明华，王文亮.肿瘤抑制基因P53突变与原发性肝癌的关系.中华肿瘤杂志，1993，15(1)：245

　　10，朱明华，Feitelson MA, London WT.HBxAg和P53蛋白结合在原发性肝癌发生中的意义.中华医学杂志，1993，73(6)：325

　　11，余新生，徐雪芳，何方法，等.肝癌高发家族对黄曲霉毒素B1的易感性.肿瘤，1981，1(1)：11

　　12，Brusick D.遗传毒理学原理.吕群，等译.上海：复旦大学出版社，1987，64

　　13，Maron DN, Ames BN. Revised method for the salmolla mutagenicity test. Mut at Res,1983,113:173