儿童6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏症的筛查

　　中华医学杂志2000年第80卷第7期

　　叶军　刘晓青　黄晓东　沈永年　陈瑞冠　顾学范

　　摘　要　目的　了解高苯丙氨酸血症患儿中6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏症(PTPSD)的发病率及PTPSD患儿临床转归情况。方法　用高效液相层析仪(HPLC)对69例苯丙酮尿症(PKU)患儿作尿新蝶呤(N)和生物蝶呤(B)测定，对异常者进行四氢生物蝶呤(BH₄)负荷试验、6-丙酮酰四氢蝶呤(PTPS)基因突变检测及BH₄、多巴、5-羟色氨酸治疗。结果　69例中9例诊断为PTPSD，其尿N/B＞38，B%＜5%。4例患儿中有4种PTPS基因突变类型，即P87S、N52S、D96N及G144R(新突变类型)。3例严重型患儿经治疗后体格发育良好，智商(IQ)70～80分，语言发育落后。1例部分型患儿未予特殊治疗，生长及智能发育正常。结论　对血苯丙氨酸增高者均需要进行四氢生物蝶呤缺乏症的筛查，可降低误诊率。

　　关键词：苯丙酮尿症　缺乏症　基因

　　随着我国对新生儿苯丙酮尿症(phenylketonuria, pKU)筛查工作的推广，许多由于苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)缺乏所导致的经典型PKU患儿得到了早期的诊治，智能发育接近正常。但有部分非典型PKU或高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia, hPA)者因其PAH的辅基——四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, BH₄)缺乏而影响苯丙氨酸(phenylalanine, phe)代谢及脑内神经递质(如多巴胺、5-羟色胺)合成，临床上易误诊为PKU；BH₄缺乏常因其合成代谢途径中6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(6-pyruvoyl-tetrahydrobiopterin synthase, PTPS)缺乏所致，其预后比经典型PKU更差，治疗方法也截然不同于经典型PKU。我们总结了十余年来对部分PKU患儿进行BH₄缺乏症(BH₄ deficiency, BH₄D)的筛查诊断、基因突变分析、特殊药物疗效和临床诊治经验。

　　对象和方法

　　一、对象

　　1.自1981～1997年在我院小儿内分泌遗传代谢门诊诊治的700余例PKU患儿中，97例经新生儿群体筛查或PKU高危筛查诊断，其余均因智能落后、发黄等原因来诊而诊断。所有这些患儿中，除了10余例诊断为PHA(血Phe＜960μmol/L)外，余均诊断为经典型PKU(血Phe＞1 200 μmol/L)。经得患儿家长的同意，对69例PKU患儿进行了BH₄D的筛查。

　　2.对BH₄D者及其父母进一步作PTPS基因突变检测，并采用特殊药物对患儿进行对症治疗。

　　二、方法

　　1.尿蝶呤谱分析：用美国Waters公司510型高效液相层析仪(HPLC)，用反相层析法对PKU患儿进行尿新蝶呤(neopterin, n)、生物蝶呤(biopterin, B)含量测定。如尿新蝶呤与生物蝶呤比(N/B)显著增高，B%＜10%，为BH₄合成酶PTPS缺乏(PTPSD)；N/B降低，B%增高，为还原酶DHPR缺乏。

　　2.BH₄负荷试验：尿蝶呤异常者进一步作该试验以助诊。试验前3 d给普食，使血Phe上升＞960 μmol/L，口服BH₄(7.5 mg/kg)，服前，服后2、4、6、8 h分别取血作Phe测定，此外，服前，服后4～8 h可分别留尿作尿蝶呤分析。

　　3.PTPS基因突变分析：抽取PTPS患儿及父母静脉血，分离淋巴细胞，提取总RNA，再经反聚合酶链反应(RT-PCR)，即以RNA为模板，加入oligo dT、反转录酶MMLV、dNTP和缓冲液等，在聚合酶链反应(PCR)仪中42℃，反应60 min，反应总体积20 μl。取cDNA 5 μl，分别加入5种引物来扩增PTPS基因DNA序列。最后采用Sanger双脱氧链末端终止测序法进行DNA测序。

　　4.BH₄D治疗：一经诊断立即给予BH₄片1～5 mg*kg^-1*d^-1以降低血Phe浓度及神经递质前质左旋多巴(L-DOPA)5～15 mg*kg^-1*d^-1，5-羟色氨酸(5-HTP)5～10 mg*kg^-1*d^-1联合治疗。治疗期间随访血Phe浓度、体格、智能发育及神经系统症状。

　　结果

　　一、尿蝶呤分析

　　69例HPA患儿尿蝶呤测定结果见表1。60例PKU者平均尿新蝶呤(N)和尿生物蝶呤(B)含量高于正常儿童参考值(N：0.28～2.6 mmol/molCr，B：0.35～2.96 mmol/molCr)；N/B稍增高(正常：0.3～0.94)，生物蝶呤百分比(B%)在正常范围(42.7%～75.9%)，符合经典型PKU诊断。其中9例患儿尿N/B极度增高至38以上；而B极低甚至测不出，B%＜5%，故诊断为PTPS缺乏症。

　　二、BH₄负荷试验

　　3例尿蝶呤分析疑诊为PTPSD者作了此试验。试验前血Phe为720～1200 μmol/L，口服BH₄片7.5 mg/kg后6 h血Phe逐渐降至120～240μmol/L。1例同时作尿蝶呤分析，试验前B%为0.1%，口服BH₄片后6 h增高至20.3%。进一步证实PTPSD诊断。

　　三、PTPSD患者家系基因突变检测

　　4例PTPS患儿及父母接受了全长cDNA分析，发现4种基因突变，即在第259位碱基发生C→T置换，使编码区87位脯氨酸(Pro)转换为丝氨酸(Ser)(P87S)；在第286位碱基发生G→A置换，使编码区96位门冬氨酸(Asp)转换成门冬酰胺(Asn)(D96N)；在第155为碱基发生A→G置换，使编码区52位门冬酰胺(Asn)转换成丝氨酸(Ser)(N52S)；在第430位碱基发生G→C置换，使144位甘氨酸(Gly)转换为精氨酸(Arg)(G144R)。G144R是国际上尚未报道的基因突变类型。4例患儿其PTPS突变基因为P87S/D96N，P87S/N52S，N52S/G144A及D96N/P87S，分别来自各自的父母亲，符合常染色体隐性遗传规律。

　　四、PTPS患儿治疗转归

　　9例患儿(男5例，女4例)中4例经新生儿筛查诊断为PKU，5例因智能障碍就诊而诊断为PKU。这些患儿经低或无Phe奶粉治疗后，虽血Phe浓度很快下降至360μmol/L以下，却出现进行性的肌张力低下，软弱无力，抬头困难，有的伴随顽固性抽痉。PTPSD患者平均诊断年龄为1.6岁(2月至6岁)。5例因诊断当时无特异性药物治疗或放弃治疗，其中4例已死亡。1例部分型PTPS缺乏，在3个月确诊后因无任何神经系统症状，仅给低Phe奶方治疗至8个月，血Phe在120～240μmol/L。6岁时IQ为82分。另3例分别在生后2个月、6个月、6岁诊断为严重型PTPSD，诊断后用神经递质前质及四氢生物蝶呤治疗，即L-DOPA(5～10 mg/kg)，5HTP(5～6 mg/kg)，每日总剂量分3～4次口服，BH₄片1～2 mg/kg，分2次口服。这些患者治疗后神经系统症状逐渐改善，肌张力恢复正常，生长发育逐步赶上并接近正常儿童。智能发育虽明显提高，但仍有一定的

表1　苯丙酮尿症及四氢生物蝶呤缺乏症患儿尿蝶呤分析结果(x±s)

　　落后，其中2例智能测定结果显示智商为70～80分。患者血Phe浓度均控制于120～360μmol/L。此外，在治疗期间患者有时会出现一过性的“On-Off”现象，即精神振奋，反应增加与精神萎靡不振，软弱无力，嗜睡等交替出现，当将每日L-DOPA总剂量分成4～6次服用，则上述现象改善。

　　讨论

　　PTPS缺乏所致BH₄D也是一种特殊类型的PKU，过去因无特异性治疗导致死亡率极高，故称恶性PKU^［1］。根据1996年国际统计资料分析^［2］，BH₄缺乏症中以PTPS缺乏最常见，全世界PTPSD共181例，我国大陆仅发现24例。为了降低误诊率，对所有PKU患儿进行BH₄D的筛查鉴别诊断，使患儿得到早期对症治疗，预防或减轻患者的智能障碍十分重要。该组在41例新生儿群体筛查诊断的PKU中筛查出3例PTPSD缺乏性BH₄D，发病率7%，高于白种人发病率1%～3%。

　　HPLC尿蝶呤分析是目前BH₄D常用的筛查手段。血Phe增高可刺激GTP环化水解酶刺激蛋白(P35)导致尿新蝶呤和生物蝶呤水平增高^［1，3］，该文60例PKU患儿尿蝶呤结果也如此。PTPS缺乏者对Phe耐受性较强，有的仅为轻度血Phe增高，因生物蝶呤合成障碍，B%极低甚至测不出，故N/B显著增高。因BH₄D者其PAH活性正常而稳定性下降，故当补充BH₄后4～6 h，血Phe很快下降，而经典型PKU因PAH缺乏，故BH₄对其无效。因此，尿蝶呤分析和BH₄负荷试验是诊断BH₄D的有效手段，有条件作PTPS酶活性测定以确诊。

　　1992年Thony等克隆了人类肝细胞PTPS的cDNA，PTPS基因位于第11号染色体(11p22.3)，全长2 kb，6个外显子。文献报道了中国PTPSD患者的基因突变类型有R25G，N52S，V56M，V70D，P87S，D96N及T106M7种，其中P87S和N52S为最常见，占70%，P87S多见于中国南北方BH₄D患者，N52S则多见于南方患者^［3，4］。该组发现的G144R是国际上未报道的突变类型。对基因突变与临床表型分析得出，N52S，P87S及D96N与严重型PTPS缺乏有关；V56M与轻型PTPSD有关^［3］。本文8例患者因脑内神经递质合成障碍而出现严重的肌张力低下，属严重型PTPSD，其中4例患者的基因突变类型与临床表型相符。1例属部分型或外周型PTPSD，其剩余的酶活性所产生的BH₄尚能满足脑内神经递质合成，仅表现为PAH功能不足而出现血Phe增高，无其他神经系统症状^［5］。

　　PTPSD的成功治疗必须尽早采用BH₄、L-DOPA及5-HTP联合治疗。本组3例严重型患儿治疗后虽体格发育进展良好，但智能发育，尤其是语言仍有落后，与一些国外报道相仿。该组长期研究探讨所得临床经验：(1)3个月内治疗者，其疗效显著。(2)联合药物治疗疗效比单独一种药物更显著，在无BH₄治疗的条件下，可用低Phe奶粉替代。(3)L-DOPA及5-HTP治疗从小剂量逐渐增加至治疗剂量，并总量至少分3～4次，以减少血浆L-DOPA半衰期短所产生的“On-Off”现象^［6］。如果加入L-deprenyl，一种单胺氧化酶B的抑制剂联合治疗，可减少“ON-Off”现象发生^［7］。(4)根据临床症状，血泌乳素(PRL)水平^［8］，有条件可根据脑积液神经递质代谢产物水平来调节药物剂量。(5)严格控制血Phe浓度在＜240μmol/L，避免血Phe浓度增高干扰神经递质前质的治疗疗效。

　　作者单位：叶军（200092上海市儿科医学研究所)

　　刘晓青（200092 上海市儿科医学研究所)

　　黄晓东（200092 上海市儿科医学研究所)

　　沈永年（200092 上海市儿科医学研究所)

　　陈瑞冠（200092 上海市儿科医学研究所)

　　顾学范（200092 上海市儿科医学研究所）

　　参考文献

　　1，Blau N, Thony B, Spada M, et al. Tetrahydrobiopterin and inherited hypephenylalaninemias. Turk J Pediatr, 1996,38:19-35.

　　2，Blau N, Barnes I, Dhondt JL. International database of tetrahydrobiopterin deficiencies. J Inherit Metab Dis, 1996,19:8-14.

　　3，Liu TT, Hsiao GR, Liu XQ, et al. Mutation analysis of the6-pyruvoyl-tetrahydropterin synthase gene in Chinese Phenylketonuria caused by tetrahydrobiopterin synthesis deficiency. Hum Mutat, 1997,11:76-83.

　　4，刘晓青，刘孜孜，萧广仁，等.非经典型苯丙酮尿症的基因突变检测.中华医学遗传杂志，1997，14：351-353.

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　　6，Tanaka Y, Matsuo N, Tsuzaki S, et al. On-off phenomenon in a child with tetrahydrobiopterin deficiency due to 6-pyruvoyl-tetraphydropterin synthase deficiency (BH₄ deficiency). Eur J Pediatr, 1989,148:450-452.

　　7，Schuler A, Blau N, Ponzone A, et al. Monoamine oxidase inhibitors in tetrahydrobiopterin deficiency. Eur J Pediatr, 1995,154:997.

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