尿路上皮肿瘤rasp21和p53蛋白和DNA含量的流式细胞定量研究

　　中国肿瘤临床1999年第22卷第3期

涂响安　赵志毅　黄春南　余明年　谢佛龙　冯家骅　刘丽萍　左连富

　　 摘要　目的：研究rasp21和p53表达和DNA倍体异常与尿路上皮肿瘤发生关系。方法：应用流式细胞术和细胞免疫荧光技术对52例尿路上皮肿瘤rasp21和p53蛋白和DNA含量进行定量检测。结果：异倍体22例(42.3％)，二倍体30例(57.7％)；异倍体肿瘤其DNA指数、增殖指数和S期细胞比率均高于二倍体肿瘤，但差异无显著性(P＞0.05)；rasp21和p53共同表达25例(48.1％)，随肿瘤病理分级分期的上升而增加(P＜0.05)；异倍体肿瘤rasp21和p53共同表达16例(72.7％)，二倍体肿瘤rasp21和p53共同阳性9例(30％)，两组间差异显著(P＜0.01)。结论：DNA倍体异常、rasp21和p53的共同表达参与尿路上皮肿瘤的发生和发展 。

　　关键词：尿路上皮肿瘤rasp21p53DNA倍体流式细胞术

　　人体肿瘤的发生和发展与细胞凋亡和凋亡相关因素密切相关，近年来研究出多种癌基因和抑癌基因如ras，p53、c－myc和bcl－2等均参与细胞凋亡的调控^[1]。ras癌基因是细胞凋亡抑制基因，野生型p53基因为凋亡促进基因，而突变型p53基因为凋亡抑制基因，体外细胞转染实验证实突变型p53和ras癌基因在细胞恶性转化过程中有协同作用^[2]。我们采用流式细胞术和细胞免疫荧光技术对52例尿路上皮肿瘤和5例正常泌尿系粘膜组织中rasp21和p53蛋白以及DNA含量进行检测，探讨其在尿路上皮肿瘤发生和发展中的作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源

　　采用存档的石蜡包埋尿路上皮肿瘤组织52例，正常泌尿系粘膜5例为对照。本组肾盂癌，输尿管癌，膀胱癌为5:1:46；WHO病理分级G₁,G₂,G₃为18:20:14;UICC临床分期T₁,T₂,T₃～T₄为

　　11:22:19;其中男性36例，女性16例；年龄24～81岁，平均54岁。

　　1.2　DNA倍体检测样品的制备

　　每例石蜡标本组织切取40μm厚组织数片，制成单细胞悬液，按文献[3]方法：1)二甲苯脱蜡；2)梯度酒精水化；3)0.5％盐酸胃蛋白酶消化；4)溴化乙腚(EB)荧光染料对细胞DNA进行荧光染色。

　　1.3　rasp21免疫荧光染色样品制备

　　采用搓网法制备单细胞样品。所用一抗为鼠抗人Ha－rasp21单抗(Ha－rasF－235－171，OncogeneScienceInc，US)，二抗为羊抗鼠FITC－IgG（军事医学科学院微生物研究所生产，批号9109）。除正常泌尿系粘膜作对照外，还设有①PBS替代rasp21单抗的阴性对照；②只加入1:400rasp21单抗的阳性对照；③只加入1:20FITC－IgG的阳性对照。染色后可见黄绿色荧光主要分布于胞膜和胞浆。

　　1.4　p53免疫荧光染色样品制备

　　间接免疫标记法，一抗为鼠抗人p53单抗(PAb1801,OncogeneScienceInc,US)，二抗同上，染色后黄绿色荧光主要分布于细胞核内。

　　1.5　流式细胞仪检测方法

　　采用美国B.D公司生产的FACS420型流式细胞仪，以2W氩离子激光器作激发光源，激发波长48.8mm，输出功率为300mW。测量数据和图形输送到HP－300Consort30计算机，应用相应的程序软件进行资料处理。测量前以鸡红细胞为标准样品，调整仪器的CV值在5％以内。

　　1.6　资料分析方法

　　1.6.1　DNA倍体分析方法　依据DNA指数(DNAIndex,DI)判断DNA倍体DI=1.0±2CV为二倍体，DI≠1.0±2CV为异倍体。

　　1.6.2　细胞周期分布计算　应用DNA细胞周期分布软件，计算出DNA显示图各时相分布百分比，以增殖指数(Proliferation Index,PI)和S期细胞比(S－PhaseFraction,SPF)表示细胞增殖活性，其计算公式为：

　　1.6.3　rasp21和p53蛋白表达的定量分析参考Morkve等^[4]提出的分析方法，以荧光指数(FluorescenceIndex,FI)表示rasp21和p53相对含量。

　　1.6.4　统计学处理采用t检验和χ²检验。

　　2　结果

　　2.1　DNA倍体与临床病理特征关系

　　根据DNA倍体判断标准，5例正常泌尿系粘膜均为二倍体，DNA指数DI=1.00±0.03；52例尿路上皮肿瘤，异倍体22例(42.3％)，DI=1.25±0.17；二倍体30例(57.7％)，DI值为±1.02±0.05，两组之间差异显著。异倍体肿瘤增殖指数PI=26.21±6.74，S期细胞比率SPF=13.74±3.91，二倍体肿瘤PI=24.38±7.35，SPF=11.95±3.57，两组之间差异无显著性（表1）。DI，PI和SPF随肿瘤病理分级分期的升级而逐渐增高，但差异无显著性。

表1　尿路上皮肿瘤DNA倍体与细胞增殖活性关系

　　*P值为t检验

　　2.2　尿路上皮肿瘤rasp21和p53表达与病理分级分期关系

　　52例尿路上皮肿瘤，rasp21阳性表达36例(69.2％)，p53阳性表达33例(63.5％)，rasp21和p53共同阳性表达25例(48.1％)；5例正常泌尿系粘膜均为阴性表达。rasp21和p53共同表达率随肿瘤病理分级分期的升级而增强(P＜0.05)， 见表 2，3）。

表2　尿路上皮肿瘤rasp21和p53共同表达与病理分级关系

p值为χ²检验

表3　尿路上皮肿瘤rasp21和p53共同表达与临床分期关系

　　 ^**P值为χ²检验

　　2.3　DNA倍体和rasp21和p53蛋白表达关系

　　22例异倍体肿瘤rasp21阳性表达20例(90.9％)，p53阳性表达18例(81.8％)，rasp21和p53共同表达16例(72.7％)；30例二倍体肿瘤rasp21阳性16例(53.3％)，p53阳性表达15例(50％)，rasp21和p53共同阳性9例(30％)；异倍体肿瘤其rasp21和p53共同阳性表达率和表达量均高于二倍体肿瘤，见表4。

表4　尿路上皮肿瘤DNA倍体和rasp21和p53表达关系

　　 *P值为t检验**P值为χ²检验

　　3　讨论

　　细胞凋亡(apoptosis)为细胞的程序性死亡，它广泛发生于肿瘤之中，尽管不是肿瘤细胞的唯一死亡方式，但它被认定为肿瘤细胞死亡的重要因素之一。随着对肿瘤发生机制研究的深入，人们认识到肿瘤细胞快速增殖过程中，同时也发生凋亡，并认为增殖和凋亡之间也存在一定平衡，这种平衡也决定肿瘤的生长速度。在膀胱肿瘤中，Lipponen等^[5]研究细胞凋亡和增殖指数可作为其预后参数，其受多种肿瘤相关基因如ras、p53、c－myc和bcl－2的调控。

　　ras癌基因家族由H－ras、K－ras和N－ras组成，共同编码一分子量为21000dalton的蛋白称rasp21。ras基因是细胞凋亡抑制基因，它抑制细胞凋亡是通过rasp21的高表达抑制细胞凋亡过程中的核酸内切酶的活性，而促进细胞的增殖。Czerniak等^[6]于膀胱肿瘤中发现H－ras突变率为44.8％(30/67)，异倍体肿瘤(58％)比二倍体肿瘤(28％)有较高的突变率。本研究结果示rasp21阳性表达率为69.2％(36/52)，随肿瘤的病理分级分期的上升而增加，且在异倍体肿瘤中阳性率为90.9％(20/22)，二倍体肿瘤阳性率为53.3％(16/30)，两组之间差异显著。这说明ras癌基因在DNA异常改变和高分级分期肿瘤中突变和异常表达rasp21增加，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和异常分化，是重要的预后参数。

　　p53基因为一肿瘤抑制基因，分为野生型和突变型。野生型p53是细胞凋亡的促进基因，在细胞DNA受损时，可使细胞周期停止于G₁期或诱导细胞凋亡。突变型p53基因则为细胞凋亡抑制基因，它通过表达异常的突变性p53蛋白可抑制野生型p53诱导的细胞凋亡，增强细胞的增殖活性，促发细胞恶变。Sidransky等^[7]用PCR－SSCP方法发现浸润性膀胱癌其p53突变率为61％。Wright等^[8]用免疫组化的方法检出膀胱肿瘤54％的p53蛋白表达率。Nakopoulou等^[9]结合流式细胞术和免疫组化对膀胱肿瘤的研究发现p53的异常表达是重要的预后参数之一，特别是伴有DNA倍体的异常改变时。本研究结果示p53蛋白阳性表达率为63.5％(33/52)，随肿瘤的病理分级分期的上升而增加，异倍体肿瘤p53阳性率为81.8％(18/22)，明显高于二倍体肿瘤的50％(15/30)，与上述结果较为一致。

　　尿路上皮肿瘤发生和发展的多阶段多步骤理论需要多个癌基因的参与和配合，野生型p53基因和ras基因是正负凋亡调节基因，而突变型p53基因则为负凋亡调节基因。体外细胞转染实验证实突变型p53和ras基因在细胞恶性转化过程中的协同作用^[2,10]。本组实验显示rasp21和p53共同阳性表达率为48.1％(25/52)，随肿瘤病理分级和分期的上升而增强，异倍体肿瘤rasp21和p53共同表达率为72.7％(16/22)，二倍体肿瘤为30％(9/32)，两组比较差异显著（表4），这结果与我们用免疫组化对rasp21和p53的检测结果较为一致^[11]。Morkve等[4]用免疫组化和流式免疫技术对支气管肺癌p53蛋白的检测结果也显示了高度一致。因此尽管DNA倍体，rasp21和p53的单独表达与尿路上皮肿瘤预后有明显关系，但结合DNA倍体改变、rasp21和p53的协同表达多参数综合分析对尿路上皮肿瘤的临床病理和预后的预测有非常重要的价值。

　　*本文为广东省卫生厅五个一工程立项课题

　　作者单位：涂响安　赵志毅　黄春南　余明年　谢佛龙　冯家骅　刘丽萍　肇庆市第一人民医院泌尿外科（广东省肇庆市526021）

　　左连富　河北省肿瘤研究所

　　参考文献

　　1 Wyllie AH. Apoptosis. Br J Cancer,1993;67:173

　　2 Hinds P,Finlay C,Levine AJ.Mutation is required to activate the p53 gene for cooperation with the ras oncogene and transformation. J Virol,1989;63:739

　　3 左连富，刘洪祥，郭建文.流式细胞术检测石蜡包埋肿瘤细胞DNA含量的样品制备方法.中华病理杂志，1988;17(3):232

　　4 Morkve O,Laerum OD. Flow cytometric measurement of p53 protein expression and DNA content in paraffin embeded tissue from bronchical carcinoma. Cytometry,1991;12:438

　　5 Lipponen P K,Aaltomao S.Apoptosis in bladder cancer as related to standard prognostic factors and prognosis.J Pathol,1994;173:333

　　6 Czerniak B,Gary L,Polly E,et al.Concurrent mutations of coding and regulatory sequence of the Ha－ ras gene in urinary bladder carcinomas.Hum Pathol,1992;23:1199

　　7 Sidransky D,Uon Eschenbach A,Tsai YC,et al. Identification of p53 gene mutations in bladder cancers and urine samples.Sciences,1991;252:706

　　8 Wright C,Mellon K,Johnston P,et al.Expression of mutant p53,c－ erbB－ 2 and the epidermal growth factor receptor in transitional cell carcinoma of the human urinary bladder.Br J Cancer,1991;63:967

　　9 Nakopoulou L,Constantinides C,Papandropoulos J,et al. Evaluation of overexpression of p53 tumors suppressor protein in superficial and invasive transitional cell bladder cancer:comparision with DNA ploidy.Urology,1995;46:334

　　10 Parada LF,Land H,Weinberg RA,et al.Cooperation between gene encoding p53 tumour antigen and ras in cellular transformation.Nature,1984;312:649

　　11涂响安，彭轼平.rasp21和p53的共同表达与泌尿系移行细胞癌生物学行为关系.中华泌尿外科杂志，1995;16(10):596