丙泊酚和氯胺酮对心肌细胞毒性作用的对比研究

　　中国新药杂志1999年第8卷第11期

　　张铁铮　王凤学　陈伟　刘晓江

　　摘要　目的：对比研究丙泊酚和氯胺酮对心肌细胞的毒性作用。方法：将经原代培养成活4d后的大鼠心肌细胞分为4组，分别为低浓度(PL，3×10^-5mol/L)与高浓度(PR，3×10^-4mol/L）丙泊酚组和低浓度(KL，1×10^-5mol/L）与高浓度(KH，1×10^-4mol/L）氯胺酮组。各组均于实验开始后8h终止反应，评定心肌细胞搏动功能，观察细胞形态学改变，测定心肌细胞酶及电解质变化。结果：组间比较，KL组心肌细胞搏动频率加快(P＜0.05)；PR和KH组搏动频率明显减慢（P＜0.05），细胞形态学亦有相应变化；LDH，AST与CK释放量增加，ALP活性下降（P＜0.05）；而PL和KL组的上述指标无明显变化；各组间电解质变化未见显著差异。结论：PR和KH组均有直接的心肌抑制作用。而PL和KL组并无心肌细胞毒性作用，且KL组表现出正性变时性和变力性作用。

　　关键词：丙泊酚　氯胺酮　心肌　细胞毒性　细胞培养

　　本研究以原代培养大鼠心肌细胞为模型，观察丙泊酚和氯胺酮对离体心肌细胞的毒性作用。

　　材料与方法

　　1　心肌细胞的制备与培养^［1］

　　取2～3d龄Wistar大鼠雌雄兼用，断颈法处死后无菌条件下摘取心室，剪成1mm³左右碎块。依次用0.1％及0.2％胰蛋白酶磷酸盐缓冲液和0.01%胶原酶磷酸盐缓冲液消化分散细胞，弃去前2次细胞悬液。后5次细胞悬液离心后弃去上清液，将沉淀物合并混悬于10mlEagleMEM培养基中。以每孔1×10⁶细胞的密度接种于含10%小牛血清及青霉素100u/ml的EagleMEM培养基的24孔培养板中。于37℃，5%CO₂，95%空气高湿度的培养箱中培养，隔48h更换培养液1次。

　　2　实验分组与药物处理

　　培养成活4d的心肌细胞更换无血清培养液后分为4组，每组6孔。分别为低浓度(PL，3×10-5mol/L)与高浓度(PR，3×10^-4mol/L)丙泊酚组和低浓度(KL，1×10^-5mol/L)与高浓度(KH，1×10^-4mol/L)氯胺酮组。各组均于实验开始后8h终止反应。

　　3　心肌细胞搏动功能评定^［1］

　　将培养板置于37℃恒温罩中，于倒置显微镜下每孔随机选择3个细胞簇评定心肌细胞搏动功能。分为:①细胞搏动正常，记录搏动频率（bpm）；②部分搏动(SB)；③无搏动(NB)；④细胞破坏(CD)。

　　4　细胞形态学观察^［1］

　　倒置显微镜下放大100倍，观察心肌细胞胞浆内空泡、颗粒及细胞膜伪足的变化，根据其改变程度分为：无变化(-)，轻度变化(

　　卄)，中度变化()和重度变化(+++)。终止反应时刮取细胞经Earls平衡盐溶液冲洗，戊二醛固定，乙醇系列脱水及临界点干燥后行透射电镜观察。

　　5　心肌细胞酶代谢及电解质测定^［1］

　　终止反应时取各组培养液，经离心后采用TechniconRA-XT(美国)全自动生化分析仪测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)和碱性磷酸酶(ALP)的活力，并用EL-ISA(美国)电解质分析仪测定上清液中K⁺，Na⁺，Cl^-及Ca²⁺的含量。

　　6　统计学处理

　　所得数据以x±s表示，行方差分析及SNK检验。

　　结　　果

　　1　心肌细胞搏动功能及其形态学变化　见表1。

　　倒置显微镜下见PL和KL组心肌细胞正常生长，呈多角型，胞浆内颗粒丰富，表面伸出大量微突起，并有较长的伪足与周围细胞相连。KH和PR组突出的变化为空泡出现，微突起消失，颗粒及伪足减少。见表1。

表1　静脉麻醉药对原代培养大鼠心肌细胞搏动频率和形态学的影响

　　 组间比较，a：P＜0.05　　透射电镜观察见PL组心肌细胞形态基本正常，心肌细胞核呈不规则形，常染色体和异染色体分布均匀，心肌纤维束、M线和Z线结构清楚，肌间线粒体大小基本一致，线粒体嵴平行排列见图1。

图1　PL组原代培养大鼠心肌细胞超微结构(×8000)

　　KL组及PR组部分心肌排列紊乱，少数线粒体嵴消失，细胞核周围水肿，胞质内有糖原颗粒，见图2，3。

图2　PR组原代培养大鼠心肌细胞超微结构(×8000)

图3　KL组原代培养大鼠心肌细胞超微结构(×8000)

　　KH组可见心肌纤维束，M线和Z线结构不清，线粒体大小不一，形态各异，见图4。

图4　KH组原代培养大鼠心肌细胞超微结构(×8000)

　　2　心肌细胞酶代谢的变化

　　见表2。PR和KH组LDH，AST与CK释放量增加(P＜0.05)，ALP活性下降(P＜0.05)。

表2　静脉麻醉药对原代培养大鼠心肌　　细胞酶释放的影响　(x±s，u/L)

　　 组间比较，a:P＜0.053　培养液电解质变化

　　各组间电解质变化均无显著差异(P＞0.05)。

　　讨　　论

　　既往研究认为，氯胺酮对心血管系统的影响可因种属、作用时间和剂量的不同而呈双向作用，对人、兔、豚鼠和雪貂具有负性变力性作用，而对大鼠和苍鼠则有正性肌力作用^［2］。丙泊酚对人、豚鼠和雪貂心血管系统具有抑制作用，但对苍鼠和大鼠并无明显影响^［3］。

　　临床推荐的诱导剂量氯胺酮为2.0mg/kg，丙泊酚为2.5mg/kg^［4］。单次静注后5min，氯胺酮血药浓度达1×10^-5mol/L，丙泊酚血药浓度最高为1.1×10^-5～8.4×10^-5mol/L^［5］。氯胺酮和丙泊酚与血浆蛋白结合率分别为20％和95％^［6］。因此，其游离成分则相应只有0.8×10^-5和0.56×10^-6～4.2×10^-6mol/L。本研究低浓度中，氯胺酮为药物有效成分的1.25倍，丙泊酚约为7～50倍。而高浓度组则皆为低浓度组的10倍。结果表明，低浓度的氯胺酮（1×10^-5mol/L）具有正性变时性和变力性作用，而高浓度的氯胺酮（1×10^-4mol/L）则有直接的心肌细胞毒性作用。在体研究和临床实验亦证实，氯胺酮具有双向作用^［1,2,7］。PL组浓度虽高于临床剂量的7～50倍，但并无明显的心肌细胞毒性作用。因此，临床所见的丙泊酚对心血管系统的抑制作用与其心肌细胞直接抑制无关。但高浓度的丙泊酚（3×10^-4mol/L，约为临床剂量的70～500倍），则表现出对心肌细胞的直接抑制作用。

　　静脉麻醉药对心肌抑制作用的主要机制为：减少跨肌膜Ca²⁺转运和抑制肌浆网对Ca²⁺的摄取，使肌浆网内Ca²⁺储存量减少，心肌收缩过程中不能获得足够的Ca²⁺，而致心肌收缩力下降^［8,9］。低浓度氯胺酮的正性变力性作用是由于增加了Ca²⁺内流所致^［10］，高浓度氯胺酮的负性肌力作用则为降低Ca²⁺内流或损伤内质网功能而引起的^［2］。本组虽未观察到离子浓度的明显变化，但却见到当心肌细胞受到伤害时，心肌细胞酶释放量和形态学皆有相应变化。KH和PR组LDH，AST和CK的活性增强，表明糖酵解增强，并伴有细胞器损伤。ALP活性下降，表明细胞膜性结构上的酶活性已发生改变，心肌细胞代谢功能出现障碍。心肌细胞酶和形态学的改变，表明细胞膜的完整性已遭受破坏，细胞的整体功能已受伤害，足以导致细胞内Ca²⁺浓度的变化及由此引起的搏动功能的变化，从而证实高浓度的丙泊酚和氯胺酮对心肌细胞的毒性作用。

　　本实验表明高浓度的氯胺酮、丙泊酚均有直接的心肌抑制作用，而低浓度的氯胺酮和丙泊酚几乎无心肌细胞毒性作用。事实上，低浓度的氯胺酮表现出正性变时性和变力性作用。

　　作者单位：沈阳军区总医院，沈阳110015

　　参考文献

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