烫伤皮肤创面炎性细胞合成CGRP，SP对3T3细胞的增殖作用

　　第四军医大学学报1999年第20卷第5期

王波涛　陈璧　胡大海　汤朝武

　　摘　要 目的: 探讨皮肤创面两种神经肽(CGRP，SP）的起源及在创面愈合中的作用.方法: 运用免疫组化观察大鼠烫伤皮肤创面上述神经肽的分布，运用原位杂交技术观察它们的mRNA表达情况，运用体外细胞培养技术研究其对成纤维细胞增殖影响.结果: 皮肤烫伤后早期一些炎性细胞从创面和创周皮肤血管游出，并对CGRP 和SP mAb免疫反应呈阳性. 伤后12 h 该细胞与皮肤内的神经纤维关系密切，伤后24 h 细胞破碎并释放出相应的神经肽免疫反应阳性的颗粒性物质. 原位杂交方法显示：烫伤后6 h 该部位相同大小细胞内表达神经肽（SP,CGRP)的mRNA. 进一步实验证实CGRP和SP 对体外培养成纤维细胞有刺激增殖作用，且相互间具有协同作用.结论: 烫伤皮肤创面神经肽CGRP和SP 可能由来自血液的炎性细胞合成释放，其对皮肤创面的愈合可能起重要的作用.

　　关键词：降钙素基因相关肽　P物质　免疫组化　原位杂交

　　0　引言

　　降钙素基因相关肽(CGRP)和P物质（SP）这两种神经肽广泛分布于外周和中枢神经系统. 已证实它们共存于皮肤感觉神经元、真皮血管周围轴突和无髓神经末梢等处. 最近，资料指出：皮肤神经系统成分通过与皮肤多种类型细胞相互作用来调节皮肤炎性反应和创面愈合过程^［1～3］. 所以皮肤炎性反应区域神经肽CGRP 和SP 的来源成为有意义的研究课题. 一系列资料证实CGRP和SP由包括脊根神经节在内的神经元合成，当皮肤受到伤害刺激时从感觉神经末梢释放. 我们运用免疫组化和原位杂交技术验证在烧伤皮肤创面神经肽CGRP和SP是否可由局部的组织或细胞合成释放，也检测它们对在创面修复中发挥重要作用的成纤维细胞（3T3）生物学特性影响.

　　1　材料和方法

　　1.1　动物模型　 雄性SD大鼠，体重180 g～220 g. 动物背部皮肤在实验前24 h 用Na₂S脱毛，用一恒温金属探头（80℃）以 1 kg压力与皮肤接触9 s 产生皮肤深Ⅱ° 烫伤，伤后创面不予处理. 伤后0.25，6，12，24，48，96 h 取材（每个时间点6只动物），正常对照组（n=6）用25℃以1 kg 的压力接触9 s.

　　1.2　免疫组化　 动物在深麻醉下开胸，经左心室灌注200 mL 冷磷酸盐缓冲液（PBS 0.01 mol/L pH 7.4),随后用40 mL/L多聚甲醛灌注固定，将皮肤烫伤创面（包括创周）取下，经后固定，脱水，做50 μm厚冰冻切片（切面垂直于皮肤表面）. 按Shu等^［4］的方法进行免疫组化染色. 所有抗体均用抗体稀释液稀释（0.01 mol/L PBS pH 7.4, 内含10 mL/L小牛血清和3 mL/L TritonX-100). 一抗为兔抗CGRP mAb（Oncogene Sci USA, 应用效价 1∶3 000）和兔抗SP mAb（Wetpa New Zealand,应用效价1∶5 000）. 二抗为羊抗兔免疫球蛋白G（Sigma, 应用效价1∶500），ABC复合物（Sigma, 应用效价1∶500）. 来自同一动物的切片粘贴于同一载玻片上，风干，脱水，封片，镜检. 对照实验即用正常兔血清替代一抗，余步骤不变. 结果显示阴性.

　　1.3　原位杂交　 烧伤后6 h 实验动物和对照动物处死，取下皮肤烫伤区于液氮中速冻，作20 μm厚冰冻切片（切面垂直于皮肤表面），并将切片用明胶粘贴于处理过的载玻片上，贮存于-70℃冰箱中备用. 检测神经肽mRNA 的寡聚核苷酸探针使用Applide Biosystems 381A DNA合成仪合成，CGRP α探针35个碱基与合成CGRP前体mRNA 序列中664-698号碱基互补^［5］，检测SP 的探针30个碱基与编码合成SP的前原速激肽A(PPTA)mRNA中175-204号碱基互补^［6］. 所有的探针用α-³⁵［S］dATP(＞1 000 Ci/mmol, Amersham)标记3′ 末端，其特异放射活性为(1.5～2.0)×10¹⁵/(dpm*g). 杂交、显影、定影及复染过程按文献［7］方法进行. 竞争性对照实验， 部分切片与含过量的未标记探针的杂交液孵育，冲洗后用含标记探针的杂交液进行杂交，结果阴性，说明本实验所用探针能特异地与组织内相应的mRNA进行杂交.

　　1.4　3T3细胞的培养和增殖　3T3细胞用含有100 mL/L 小牛血清DMEM的培养基培养，神经肽CGRP （Penisula lab,USA）和SP(Sigma, )用前用培养液稀释成终浓度为( 10^-6～10^-9 )mol/L. 用³H-TdR标记法检测神经肽对成纤维细胞DNA 合成的影响. 步骤是：3T3细胞用含100 mL/L小牛血清的DMEM 配成一定浓度并加入96孔培养板中（5 000个细胞/孔），在37℃孵箱中过夜使细胞附壁，而后用无血清的DMEM 洗2次，随后加入用含有20 mL/L小牛血清DMEM的配制的不同浓度CGRP和(或)SP, 同时作空白对照. 37℃孵育12 h后加入³H-TdR（37 GBq/孔）继续孵育12 h，多头细胞收集器将细胞转移至玻璃纤维纸上，用Becman液体闪烁计数器测cpm值. 结果以正常对照的百分数表示.

　　2　结果

　　2.1　免疫组化和原位杂交定位　烫伤后15 min， 创面、创周内可见CGRP 和SP免疫反应阳性的炎性细胞从局部血管游出，进入真皮组织. 而后细胞数量逐渐增多，在伤后6 ，12 h达到较高水平，伤后12 h该细胞与创面真皮内含CGRP- 或含SP- 神经末梢密切接触（Fig 1A，Fig 2A). 烫伤后24 h这些细胞染色增深，破碎并释放出CGRP-和SP- 免疫反应阳性的颗粒性物质进入真皮（Fig 1B, Fig 2B），烫伤48 h 以后该细胞消失.

　　Fig 3～4显示，伤后6 h烫伤区皮内细胞中表达CGRP mRNA，也表达编码SP 的前原速激肽A(PPTA) mRNA. 以上的免疫组化和原位杂交定位，在正常对照组均为阴性.

　　2.2　CGRP 和SP 对3T3 细胞DNA合成的影响　CGRP 和SP 以剂量依赖方式刺激培养的3T3细胞DNA 合成. 在(10^-5～10^-7 )mol/L这一浓度范围内CGRP 和SP表现出协同作用(Fig 5).

　　3　讨论

　　3.1　炎性细胞合成和释放CGRP及SP　 炎性细胞包括巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞等，在皮肤创面（含烧伤）炎性反应期，该细胞从局部血管游出进入创面，在保护和促进创面愈合中发挥多种重要作用. 具体有以下几个方面：参与免疫反应；有粘附和防御细菌作用；产生多种调节细胞增殖、分化和局部炎性反应的物质，如白细胞介素，肿瘤坏死因子，成纤维细胞生长因子和转移生长因子等. 本结果显示：组织受到伤害时，炎性细胞可能产生和释放 CGRP,SP进入创面组织. 但目前尚缺乏相关资料，该炎性细胞的种类也需进一步鉴定，根据该细胞的形态学特点作者推测该细胞可能为巨噬细胞.

　　已有学者发现CGRP和SP 能刺激白细胞粘附于血管内皮，对T淋巴细胞或巨噬细胞具有趋化作用^［8～10］； 本实验显示烫伤后12 h创面的含CGRP 和含SP的神经末梢与相应神经肽免疫反应阳性细胞关系密切，这种现象可能正是由于神经末梢释放的神经肽CGRP 和SP 对该炎性细胞趋化作用所致，因为越靠近神经末梢则所释放的神经肽浓度越高，所以（Fig 1，2）表现为靠近神经纤维末梢附近的炎性细胞数量较多.

　　3.2　CGRP 和SP 对成纤维细胞DNA 合成的影响　成纤维细胞在创面修复中发挥重要的作用, 其增殖能力是决定创面愈合的重要因素之一. 本实验结果显示伤后24 h炎性细胞释放CGRP和SP 进入真皮，也证实神经肽CGRP 和SP 不仅单独使用能够以剂量依赖方式刺激成纤维细胞DNA 合成，二者联合时有协同作用（Fig 5）. 提示它们可能在创面愈合过程中发挥重要的作用.

　　图 1　SP-IR炎性细胞(A)伤后12 h创周真皮含SP神经与炎性细胞关系密切；(B)伤后24 h创面真皮内炎性细胞破碎并释放SP-IR颗粒性物质

　　Fig 1　SP-IR inflammatory cells. (A) Inflammatory cells were associated with SP-containing nerves in wound margin dermis 12 hrs post burn 　 ×200; (B) Inflammatory cells disintegrated and released SP-IR materials into the wound margin dermis 24 hrs post burn　 ×400

2　CGRP-IR炎性细胞（A)伤后12 h创周真皮含CGRP神经与炎性细胞关系密切,（B)伤后24 h 创面附近炎性细胞破碎并释放CGRP-IR颗粒性物质进入真皮

　　Fig 2 CGRP-IR inflammatory cells. (A)The cells were associated with CGRP-containing nerves in wound margin dermis 12 hrs post burn　 ×400; (B) The cells were disintegrated and released CGRP-IR materials into the wound margin dermis 24 hrs post burn　 ×400

3　烫伤后6 h 炎性细胞表达CGRP mRNA

　　Fig 3　The mRNA of CGRP in inflammatory cells was expressed 6 hrs post burn　×1 000

4　伤后12 h炎性细胞表达编码合成SP的PPTA mRNA

　　Fig 4　The mRNA of PPTA encoding SP in inflammatory cells was expressed 12 hrs post burn　 ×1 000

　　图 5　SP 和CGRP 对体外培养的3T3 DNA合成的影响

　　Fig 5　Effects of SP and CGRP on DNA synthesis in cultured 3T3 cells

　　n=3; ^aP＜0.05, ^bP＜0.01 vs control.

　　基金项目：全军九五重点课题　No.96L043

　　作者简介：王波涛，男，1966-2-16生，辽宁省昌图县人，汉族. 1990第四军医大学毕业，博士研究生，发表论文6篇，导师陈　璧. Tel：（029）3375298　Fax：3251734　E-mail　burns@ fmmu.Edu.cn

　　作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心烧伤外科， 陕西 西安 710033

　　参考文献

　　1 Ansel JC, Kaynard AH, Armstrong CA et al. Skin-nervous system interactions. J Invest Dermatol, 1996;106(1):198-204

　　2 Hosoi J, Murphy G, Egan C et al. Regulation of langerhans cell function by nerves containing calcitonin gene-related peptide. Nature,1993;363(13):159-163

　　3 Pencelli C, Rantini F, Giannetti A. Neuropeptides and skin inflammation. Dermatology, 1993;187(13):153-158

　　4 Shu S, Ju G, Fan L. The glucose oxidase-DAB-nickel method in peroxidase histochemistry of the nervous system. Neurosci Lett, 1988;85(1):69-171

　　5 Amara SG, Arriza JL, Leff SE et al. Expression in brain of a messenger RNA encoding a novel neuropeptide homologous to calcitonin gene-related peptide. Science,1985; 229(11):1094-1097

　　6 Krause JE, Chirgain JW, Carter MS et al. Three rat preprotachykinin mRNAs encode the neuropeptide substance P and neurokininA. Proc Natl Acad Sci USA, 1987;84(6):881-885

　　7 武胜昔，吕葆真， 李继硕. α-和β-CGRP及PPTA mRNAs 在大鼠三叉神经节神经元中的共同表达. Chin J Neurosci, 197; 4(1):1-6

　　8 Hartung HP. Activationof macrophages by neuropeptides. Brain Behav Immun， 1988;2(2):275-281

　　9 Sung CP, Arleth AT, Aiyar N et al. CGRP stimulates the adhesion of leukocytes to vascular endothelial cells. Peptides,1992; 13(5): 429-433

　　10 Foster CA, Mandak B, Kromer E et al. Calcitonin gene-related peptide is chemotactic for human T lymphocytes. Ann NY Acad Sci, 1992;657(7):397