人脑胶质瘤尿激酶型纤溶酶原激活因子及其抑制因子表达的研究^＊

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第7期

步星耀　章翔　王连刚　于耀宇　易声禹

　　 摘　要　目的：研究53例人脑胶质瘤和8例正常脑组织uPA、PAI₁、PAI_２表达水平。方法：采用免疫组化方法。结果：在8例正常脑组织中，uPA、PAI₁和PAI_２表达阴性，低级别（Ⅰ、Ⅱ）胶质瘤uPA、PAI₁表达水平较低，而高级别（Ⅲ、Ⅳ）胶质瘤uPA、PAI₁表达水平显著升高（P〈0.05 ）

　　关键词：胶质瘤　纤溶酶原激活因子　纤溶酶原激活因子的抑制因子

　　人脑胶质瘤的恶性表型以局部侵袭和血管生成为主要特征。细胞外基质的蛋白分解是肿瘤细胞浸润和侵袭过程中肿瘤血管化所必需的第一步。纤溶酶原激活因子（plasminogen activators,PAS）催化纤溶酶原向纤溶酶的转化，后者可降解大量的组织蛋白，并将无活性的胶原酶原转变成有活性的胶原酶，从而降解胶原类基质。研究发现，高水平的尿激酶型PA（uPA）与肿瘤的侵袭过程密切相关^[1]；多种肿瘤组织的恶性发展伴有uPA的抑制因子1型（PAI₁）和2型（PAI_２）量的变化^[２]。本研究采用免疫组化方法研究uPA、PAI₁、PAI_２在正常脑组织和各级别胶质瘤组织中的表达，探讨其与生物学行为的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1组织标本

　　本院存档的石蜡包埋胶质瘤组织53例，均经HE染色，病理组织学检查证实。其中胶质瘤Ⅰ级3例，均为毛细胞型星形细胞瘤。Ⅱ级20例，包括原浆型星形细胞瘤11例、纤维型星形细胞瘤9例。Ⅲ级13例，包括间变型细胞瘤11例，星形母细胞瘤2例。Ⅳ级17例，包括胶质母细胞瘤14例，髓母细胞瘤3例。正常脑组织8例由减压术中取得。

　　1.2免疫组化研究

　　鼠抗人uPA、PAI₁和兔抗人PAI_２多抗由Diagnostica公司生产，ABCKit由Dako公司生产。主要步骤：1)5μm厚切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。2)加uPA或PAI₁单抗，PAI_２多抗，4℃过夜。3)加生物素化鼠/兔抗IgG40分钟。4)加ABC复合物60分钟。5)0.04％DAB－HO显色。6)苏木素复染后，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。

　　以PBS代替一抗作对照染色，细胞浆有棕黄色颗粒者为阳性标记。阳性细胞数为0记作(－)，阳性细胞数占肿瘤细胞数25％以下为(＋)，25％～75％为(＋＋)，＞75％为(＋＋＋)。

　　1.3统计学处理

　　采用Mann－Whitney检验和等级相关分析。

　　2　结果

　　2.1uPA表达

　　uPA阳性染色为定位于肿瘤细胞胞浆的棕黄色颗粒，增殖的血管内皮细胞亦阳性显色（图1）。8例正常脑组织均未见uPA表达；胶质瘤病理分级与uPA表达，随病理分级的增高，各级间的阳性细胞检出率亦随之增高（附表）。除Ⅰ级与Ⅱ级无显著性差异外（P＞0.05），其余各级间比较均有显著性差异（P〈0.05）。

　　图1ABC免疫组化染色，人脑胶质瘤Ⅳ级uPA表达阳性，阳性染色定位于肿瘤细胞胞浆，呈棕黄色×400

附表uPA、PAI₁在人脑胶质瘤的表达

　　2.2PAI1表达

　　PAI₁阳性染色定位于肿瘤细胞胞浆，呈棕黄色，血管内皮细胞、基底膜及周围结缔组织亦可见阳性显色（图2）。8例正常脑组织均未见PAI₁阳性表达；胶质瘤的PAI₁表达随病理分级的增高，阳性细胞检出率亦随之增高（附表）。除Ⅰ、Ⅱ级间无统计学意义外（P＞0.05），其余各级间比较均有显著性差异（P〈0.05）。

　　图2　人脑胶质瘤Ⅲ级PAI1，表达阳性，定位于肿瘤细胞胞浆，呈棕黄色，血管内皮细胞、基底膜及周围结缔组织亦可见阳性显色×200

　　2.3uPA和PAI₁在脑胶质瘤表达关系

　　在本组53例脑胶质瘤组织中，uPA与PAI₁表达呈显著正相关（r=0.51,P〈0.01）。

　　2.4PAI_２表达

　　8例正常脑组织表达阴性；53例胶质瘤组织仅3例PAI_２呈低表达，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ级各1例，阳性染色主要定位肿瘤细胞胞浆。

　　3　讨论

　　恶性肿瘤侵袭临近正常组织的能力，涉及到肿瘤细胞生长和播散到周围正常组织屏障的破坏，在此过程中，肿瘤细胞分泌的PAs提供了关键性的细胞分子作用机制^[3]。uPA既可以酶原形式，也可以活性酶形式结合到特定的细胞表面受体，使纤溶酶原活化成纤溶酶，与其它蛋白分解酶一同引起组织降解和细胞迁移，在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用^[4]。本研究中，随人脑胶质瘤分级的增高，肿瘤恶性程度增加，uPA表达水平显著性升高，而正常脑组织则无uPA表达，表明uPA在胶质瘤的发生和演进过程中的作用可能通过增加肿瘤细胞的侵袭力来实现。

　　Moonen^[5]等用新生大鼠小脑显微移植的星形胶质细胞，观察uPA对胶质细胞的有丝分裂作用，发现提呈的人uPA可明显促进星形胶质细胞增殖。因此推论，脑损伤的原发效应是uPA增多，进而诱发胶质细胞增生。虽然有学者认为损伤是脑肿瘤的诱因，但是，损伤与脑肿瘤的确切关系尚有待阐明。Hsu等^[3]最近的研究中发现，临近肿瘤或瘤细胞浸润的脑组织，反应性星形细胞uPA表达阳性。结合本实验结果，作者认为uPA促胶质细胞增殖作用可能介导胶质细胞的恶性转化，在胶质瘤发生和发展过程中，促进其恶性演进。

　　机体内蛋白酶与蛋白酶抑制物相互协调、相互作用，保持着体内的调节平衡。PAS活性受PAI1和PAI_２的调节，后二者皆为丝氨酸蛋白酶抑制物超家族（Serpin）的成员，与PAI_１相比，PAI_２是uPA更为特异的抑制物。在细胞水平和动物模型上，已证明PAI_２可有效抑制肿瘤细胞的侵袭^[６]。本实验中，PAI_２在胶质瘤组织偶有低表达，可能是胶质瘤发展过程蛋白酶抑制物表达失衡的表现，确切机理尚需进一步研究。PAI_１在乳腺组织中的升高与uPA相平行^[７]；本实验中，胶质瘤组织PAI_１表达水平与uPA表达呈显著正相关，表明PAI_１在保护由uPA引起的自身组织细胞降解方面起重要作用，在一定程度上促进了肿瘤的发展。

　　Yamamoto等^[8]研究发现，恶性胶质瘤血管内皮细胞PAI_１mRNA呈高表达；本研究证实，PAI_１蛋白定位于血管内皮细胞、基底膜及管周结缔组织，表明PAI_１与胶质瘤血管生成有关。肿瘤的发生和发展依赖于肿瘤血管生成，同时，肿瘤血管生成的本身就具有一定的侵蚀性，瘤细胞可沿由新形成的血管所开启的组织裂隙向外侵袭至周围组织^[9]。PAI_１正常脑组织无表达，低度恶性级别胶质瘤PAI_１低表达，高级别胶质瘤PAI_１过表达，提示PAI_１在胶质瘤的恶性发展中的作用可能与其促胶质瘤血管生成有关。

　　＊本文课题受国家博士后基金资助

　　作者单位：步星耀　章翔　于耀宇　易声禹　第四军医大学西京医院神经外科（西安市710032）　王连刚　第四军医大学西京医院实验外科

参考文献

　　1　Pyke C,Kristensen P,Ralfkiaer E,et al.Urokinase plasminogen activator is expressed in stromal cells and its receptor in cancer cells at invasive foci in human colon adenocarcinomas.Am J Pathol,1991;138:1059

　　2　Boucher C,Spyratos F,Martin PM,et al.Prognostic value of urokinase-type plasminogen activator(uPA)and plasminogen ac-tivator inhibitor PAI₁ and PAI₂ in breast carcinomas.Br J Cancer,1994;69:398

　　3　Hsu DW,Efird JT,Hedley-whyte ET,et al.Prognostic role of urokinase-type plasminogen activator in human gliomas.Am J Pathol,1995;147:115

　　4　Blasi F.Surface receptors for urokinase plasminogen activator.Fibrinolysis,1988;2:73

　　5　Moonen G,Grau-Wagemans MP,Selak I,et al.Plasminogen activator is a mitogen for astrocytes in developing cerebellum.Brain Res,1985;352:41

　　6　Kraithof EKO,Baker MS,Bunn CL.Biological and clinical aspects of plasminogen activator inhibitor type2.Blood,1995;86:4007

　　7　Grondahl-Hansen J,Christensen IJ,Rosenquist C,et al.High levels of urokinase-type plasminogen activator and its inhibitor PAI--1 in cytosolic extracts of breast carcinomas are associated with poor prognosis.Cancer Res,1993;53:2513

　　8　Yamamoto M,Sawaya R,Mohanam S,et al.Expression and cel-lular localization of messenger RNA for plasminogen activator in-hibitor type 1 in human astrocytomas in vivo.Cancer Res,1994;54:3329

　　9　高进,主编.癌的侵袭与转移.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1996：187