CD₃₄ 组化法在瘢痕微血管构筑中的应用研究

　　中国烧伤创疡杂志2000年第1期

　　李小静　宁金龙　张林　孟刚

　　摘　要：目的：探讨瘢痕微血管构筑在瘢痕形成、发展及临床防治中的意义。方法：利用CD₃₄血管内皮细胞可靠标记显示瘢痕微血管构筑，以期研究不同类型的瘢痕，同一类型瘢痕的不同时期以及同一瘢痕内不同区域的微血管构筑间的差异。结果：不同类型的瘢痕间、瘢痕内不同区域及不同时期间瘢痕微血管密度均有明显统计学差异(p＜0.01)。结论：增生性瘢痕内的微血管密度明显高于萎缩性瘢痕的微血管密度；瘢痕早期微血管密度高随着病程延长而逐渐减少；瘢痕交界处为较幼稚瘢痕，血管最为丰富，能代表整个瘢痕的生物学行为。因此可把此区作为研究瘢痕发生、发展与转归的重点。

　　关键词：瘢痕　微血管构筑

　　皮肤烧、创伤或切口愈合后发生瘢痕增生或瘢痕疙瘩一直是外科医生，特别是整形外科医生的一项常见的临床难题，迄今尚无有效的治疗方法。目前对瘢痕研究颇多，但很少涉及瘢痕的微循环，对瘢痕微血管构筑的二维向构筑也鲜有报道。研究瘢痕的微血管构筑对瘢痕的临床防治具有重要价值。本文利用血管内皮细胞最可靠的标记-CD₃₄内皮细胞抗原来显示瘢痕的微血管，效果满意。

　　材　　料

　　1997～1998年安徽医科大学附属医院整形外科手术瘢痕标本40例，其中增生性瘢痕23例，瘢痕疙瘩7例，萎缩性瘢痕10例。沿瘢痕最大径垂直切开皮肤，分别在瘢痕中央及瘢痕与正常皮肤交界处取材。本组年龄最大为72岁，最小为8月。头面部瘢痕10例，上肢瘢痕17例，下肢瘢痕4例，躯干部9例。〈1年的瘢痕31例〉1年的瘢痕9例。

　　方　　法

　　上述标本经10%中性福尔马林固定24～72小时后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成4um连续切片3张。一张作HE染色，余作免疫组化染色所用。CD₃₄单克隆抗体及试剂盒均购自福洲迈新免疫组化试剂公司。

　　4um石蜡切片60℃烤箱内烤片3小时后，脱蜡至水；内源性过氧化酶封闭液10min，室温；0.01m,pH 7.4PBS10min，室温；羊血清蛋白封闭切片，15min;CD₃₄单克隆抗体37⁰c，1小时；0.01m,pH 7.4PBS洗3min×3次；抗鼠二抗，室温30min;0.01m,pH 7.4PBS洗3min×3次；S-P试剂，室温30min;0.01m,pH 7.4PBS洗3min×3次；5mgDAB+PBS10ml+0.3%H₂O₂100ul，显色10～15min；流水冲洗、脱水中性树脂封片。

　　每张切片在中央区及周边区随机选各5个高倍视野，求起平均数，按Weidner计数方法换算出每mm²血管数量。所有血管均计数在内，包括染成棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇至管腔跟大、更大的血管。并对不同类别组间血管密度及同组周边、中央区及正常组织间血管密度进行x²检验，p＜0.05有统计学意义。

　　结　　果

　　1.瘢痕组织的形态学观察　瘢痕组织HE染色光镜下观察可见(1)疤痕中央区：①血管腔小、壁厚、无明显分支；②无明显平滑肌成份；③血管细胞呈增生状态，形态为柱状或立方状；④血管腔内可见红细胞，部分管腔呈闭塞状；⑤血管周细胞增生；(2)表皮与瘢痕组织：①血管腔较大，可见分支；②血管壁较薄；③血管多与表皮垂直排列，并向下深入疤痕内(图1)；④血管周围见淋巴细胞、浆细胞、肥大细胞浸润(图2)；(3)瘢痕与两侧及其下方组织交界处：①血管数量多于瘢痕中央区；②部分血管腔大，壁薄；③血管周围亦常见慢性炎细胞浸润；④部分病例瘢痕周围脂肪组织萎缩，坏死并见异物巨细胞浸润。

表皮鳞状上皮下血管垂直于表皮并向下深入瘢痕内HE×200

瘢痕周边区,血管周围见淋巴细胞,浆细胞浸润HE×400

　　2.CD₃₄免疫组化显示微血管结果　血管呈棕黄色，小血管腔多为类圆形；部分血管无明显管腔，呈条索状；但切片上背景清晰，易于做血管计数(图3)。增生性瘢痕组，中央区与周边区血管度比较，周边区血管密度亦多于中央区(p＜0.01图4)；增生性瘢痕的血管密度亦高于正常真皮组织内血管密度(p＜0.01)。比较增生性瘢痕与萎缩性瘢痕血管密度，发现前者明显高于后者(p＜0.01)。

瘢痕中央区部分血管腔闭塞,呈条索状S-P法×100

瘢痕与正常交界处,周边血管密度大于中央区S-P法×100

　　讨　　论

　　1.CD₃₄是检测微血管的较好方法　微循环形态学的研究是涉及解剖学、组织学、病理学、药理学生物化学、临床医学的多学科课题^［1］。常用的方法有灌注法、造影法及染色法。基于瘢痕的神经血管分布不同于一般正常组织；常规灌注法因灌注压力过大或过小，造成血管破裂或充盈不足，同时因为有充填剂置于血管中，微血管也不易保持其自然状态。我国汤少明等率先利用硷性磷酸酶组化法研究瘢痕微血管构筑，对显示瘢痕微血管构筑进行了初步尝试^［2］。

　　CD₃₄是一种110Kda的糖基化跨膜糖蛋白，出现在人类生血祖细胞和血管内皮细胞上，CD₃₄内皮细胞抗原在毛细血管、小血管内皮细胞呈稳定强阳性，被认为是目前血管内皮细胞的最可靠标记，其突出优点是不需向血管内灌注填充剂、示踪剂等物；不受灌注充盈的影响，对毛细血管无刺激作用；保持了微血管的自然状态和管径大小；微血管显影效果良好，背景染色浅，血管与周围组织对比明显，这对进行皮肤及移植组织微血管的形态计量学研究十分重要。冰冻切片操作简便，属常规方法，可长期保存；血管不易褪色，便于回顾性研究；方法适用范围广，人和动物组织均适用；可进行连续切片，可塑形确立微血管的立体构筑。因此CD₃₄是目前血管内皮细胞最可靠的标记，是检验微血管构筑的可靠方法^［3］。

　　瘢痕是人体创伤愈合过程中必然和必须的产物，不管是何种类型的皮肤瘢痕，往往伴有轻重程度不等的功能障碍及外观影响，亦即瘢痕畸形，尤其是增长性瘢痕和瘢痕疙瘩是现代医学面临的一大难题。对瘢痕的组化研究主要集中在成纤维细胞及与胶原合成与分解有关的脯氨酸羟化酶，a-球蛋白胶原酶。但很少涉及瘢痕的微血管构筑。从瘢痕的临床表现，瘢痕的超微结构以及其治疗机制，手术时机的选择及治疗效果观察上，均与瘢痕的微血管构筑有关。

　　2.方法学的意义　我们采用血管内皮细胞标记-CD₃₄内皮细胞抗原来显示瘢痕的微血管构筑，提供了不同种类瘢痕微血管初步的形态学资料：增生性瘢痕的血管密度高于正常真皮组织及萎缩性瘢痕的血管密度，且有非常显著的统计学差异。因此认为，瘢痕的微血管构筑在增生性瘢痕的形成、发展过程中起着不容低估的作用。CD₃₄组化法在瘢痕组织化学中的应用对进一步研究瘢痕的微循环的二维向构筑、直径、密度和血管表面面积等研究具有重大意义。

　　在HE染色中发现，瘢痕内血管多与表皮垂直排列，并向下深入瘢痕内；瘢痕与两侧及其下方组织交界处血管数量多于瘢痕中央区，血管周围常见慢性炎细胞浸润。结合免疫组化结果，我们认为可将瘢痕与正常的交界区作为瘢痕研究的重点。增生性瘢痕与瘢痕疙瘩的形成是一复杂的局部和全身病理生理过程，微血管的变化可能在其形成中起着推动作用。但其起因、机理及上述两者微血管的构筑间的区别以及瘢痕的形成与全身免疫反应间的关系有待进一步研究。

　　作者单位：李小静（安徽医科大学附属医院(230022)）

　　宁金龙（安徽医科大学附属医院(230022)）

　　张林（安徽医科大学附属医院(230022)）

　　孟刚（安徽医科大学）

　　参考文献：

　　［1］戎广亚，田中.微血管形态学研究的常用方法及评价.中国病理生理杂志，1988，4(4)：247～249

　　［2］汤少明，梁杰，颜大胜.碱性磷酸酶组化法在研究瘢痕微血管构筑的应用.中国烧伤创疡杂志，1991，3；9～13

　　［3］Hollingsworth H,Kohn E,Steinberg S,et al.Tumor angiogenesis in advanced stagy ovarian carcinoma.Am J Pathol,1995;147:33～41