视乳头细胞外基质研究进展

北京市眼科研究所 李杨 综述

北京同仁医院 刘磊 审校

　　摘要：原发性开角型青光眼是一种常见致盲病，其视神经损害的原发部位在视乳头筛板。筛板对视神经轴突具有营养和支持作用。筛板结构的完整性依赖于筛板细胞外基质（ECM）的组成及分布，因此有关视乳头特别是筛板细胞外基质的研究引起了越来越多学者的关注。本文就近年来有关视乳头筛板细胞外基质大分子成分的免疫组织化学，分子细胞生物学研究加以综述。

　　原发性开角型青光眼是一种常见致盲病，临床上以视乳头凹陷进行性扩大及视野缺损进行性加重为特点，眼压增高是造成青光眼视神经萎缩的一处常见危险因素，但其它危险因素如种族、年份、血管疾病在青光眼的发病中也至关重要。近年来的研究认为视乳头筛板是青光眼神经轴突损害的原发部位，筛板对视神经轴突具有营养支持作用。筛板结构的完整性依赖于筛板结细胞外基质（ECM）的组成及分布，因此有关视乳头特点是筛板细胞外基质的研究引起了越来越多学者的关注。本文就近年来有关视乳头筛板细胞外基质大分子成分的免疫组织化学，分子细胞生物学研究加以综述。

　　从组织学上看视乳头由内到外分为三个部分，即筛板前区、筛板、筛板后区^[1]。在筛板前区，视网膜神经节细胞纤维汇聚并转90⁰形成视神经，此处神经纤维无髓鞘，神经束由星形胶质细胞束分隔，该区后筛板，又可分为脉络膜筛板和巩膜筛板两部分，巩膜筛板由大约10层胶原结缔组织板组成，这些板样结构横穿巩膜管，每层板均有数百个孔洞，各层板上的孔洞排列成一线构成视神经轴突离开眼球的通道，这些结缔组织板即为筛板。筛板后为筛板后区，该区的神经纤维为有髓纤维，神经束由含有血管及星形胶质细胞的神经束膜分隔，神经束膜组织是筛板组织的延续。

　　细胞外基质（ECM）是让细胞群作为组织发挥功能的结构支架^[2]。它由特殊大分子组成，这些大分子以向何形式聚集在一起，赋予其所支持组织强度、柔韧性和弹性。细胞外基质结构的改变将导致发育、老化、疾病及细胞行为的变化。细胞外基质分子、细胞膜与细胞内部是连续的。因此许多细胞功能依赖并受控于细胞外基质，它为细胞提供支架、为细胞粘连提供吸附点并指导细胞分化。更为重要的是细胞外基质的生物合成和分解解决组织或器官的结构。因此组织或器官的生长、形态和稳定依赖细胞外基质的重塑，组织或器官的病理改变与细胞外基质生物合成与分解代谢的变化相关。

　　胶原、弹性蛋白、蛋白多糖和吸附因子是构成细胞外基质的主要成分。这些大结构分子分布于细胞外，无酶活性。细胞终生合成这些大分子，并与其周围合成的其它大分子相互接触、互相作用。在某些组织如骨、软骨和巩膜，细胞外基质的代谢很慢；而另一些组织如疏松结缔组织，细胞外基质代谢较快。激素、生长因子、营养因子和局部微环境控制并调节细胞外基质的代谢。

　　细胞外基质可分为基底膜和间质型两在类。基底膜是一种独特但又广泛存在的细胞外基质。它将合成自身的细胞与间质（常为基质）分开。基底膜位于上皮或内皮细胞的一侧，环绕脂肪细胞、肌肉细胞和雪旺（Schwann）氏细胞的各个面。基底膜厚度大约为100nm，是由胶原、非胶原蛋白、蛋白及糖构成的连续膜。功能上，基底膜为细胞提供吸附点、构成细胞运动的屏障，由于其所具有的柔韧性和弹性。其两侧不同组织可具有不同的物理特性。

　　间质型细胞外基质具有结缔组织的特点，由成纤维细胞族合成。间质型细胞外基质在同一类型细胞周围，主要功能是保持器官的形态。胶原、弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白构成其复杂骨架，为组织或器官提供强度和机械支持。

　　一、正常视乳头筛板的细胞外基质

　　（一）胶原

　　胶原是细胞外基质蛋白的一类主要成分，迄今在哺乳动脉的组织和细胞培养中已发现至少19种胶原，大多数的组织或细胞与其自身特殊的结构和功能特点相对应，含有一种以上的胶原蛋白。目前从蛋白质水平和mRNA水平均已证实人眼视乳头筛板存在胶原蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ5种胶原。

　　胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ是胶原纤维，属于间质型细胞外基质，构成结缔组织细胞间质的纤维成分。Hernandez等^[3-5]用免疫荧光及免疫过氧化物酶等方法发现，在筛板及插入区（筛板插入巩膜部）胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ轻度弥漫斑点样着染。他们还观察了由新生儿到99岁不同年龄组人眼科乳头细胞外基质，结果表明：随着年龄的增长筛板的老化，在筛板前区胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的阳性染密度无明显变化，而在筛板区这两种蛋白着染密切随着年龄的增大而透渐增加。Goldbaum等^[6，7]用Streptiavide辣根过氧化物酶等方法观察正常人视乳头，结果表明胶原Ⅰ、Ⅲ在巩膜，筛板及筛板后区的神经束膜均有相同阳性染色。胶原Ⅴ、Ⅳ在筛板纤维组织中呈丝样着染，似乎存在于胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ所形成的纤维束中。筛板核心含有胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ无疑为该组织提供也强度和韧性。随着年龄的增长，这些胶原纤维含量增加，将引起筛板顺反应、弹性和柔韧性的丧失。

　　胶原蛋白Ⅳ上基底膜的主要胶原成分，它的超微分子结构最适合于基底膜的高弹性和机械支持。早在80年代中期。Hernandez等^[4]用免疫荧光支研究正常人视乳头细胞外基质，结果表明在视乳头筛板有胶原蛋白Ⅳ阳性着染，阳性染色物质呈层状横向排列，这些阳性着染物也存在于血管周围，神经束中无阳性反应物。在筛板前区阳性反应物只存在于血管周围，在筛板后区阳性反应物在神经束膜周边线样排列，血管周围也有阳性着染。随后Hernandez等^[5]用免疫氧化物酶法（SP）及双标免疫荧光法对正常人视乳头细胞外基质进行了进一步研究，结果发现，筛板区存在着致密的胶原蛋白Ⅳ免疫过氧化物酶阳性染色，胶原蛋白Ⅳ形成一个完好的薄层结构包绕筛板，与巩膜相邻的插入部也存在阳性反应，而在巩膜则无该胶原蛋白的阳性染色。对胶原蛋白Ⅳ及弹性蛋白双标免疫荧光结果表明，胶原蛋白Ⅳ和弹性蛋白是筛板和插入部分的主要成分，高倍显微镜下显示，弹性蛋白纤维构成筛板的核心，核心板由胶原蛋白Ⅳ包裹。在插入部Ⅳ型纤维阳性染色呈丝网状穿入巩膜，使筛板牢固地固定于巩膜上。随着年龄的增长，胶原蛋白Ⅳ在筛板前区和后区的着染密度逐渐增加，在筛板区的筛板着染密度也逐渐增加，但环绕血管周围的阳性着染密度无明显变化。胶原蛋白Ⅳ相互连接的板层结构形成一疏松大分子网，该网具有弹性和基底膜层样组织的机械稳定性。这些层样结构横悬佳环绕神经束，以满足筛板吸收压力的弹性需要。

　　（二）弹性蛋白

　　弹性蛋白是存在于许多组织细胞外基质的纤维蛋白。该分子是体内最不易溶解的蛋白。弹性蛋白承受机械压力后可很好地回弹被喻为生物橡皮，在组织中具有独特的生理作用。弹性纤维由弹性蛋白（一种不溶性无定形物质）和微纤维组成，这些微纤维可能决定弹性蛋白纤维的形态和大小。弹性蛋白常与胶原蛋白共同分布于组织中，这些大分子构成的相对比例决定组织的物理强度和弹性。Hernandez等^[3-5]在80年代用免疫荧光及免疫过氧化物酶法就已证实在筛板及插入区有大量的弹性蛋白，弹性蛋白以纤维形式存在走行与筛板束一致。在筛板前区弹性蛋白仅在胶质束间呈弱阳性反应。90年代初,Hernandez等^[8]用免疫电镜对胎儿及出生后婴儿的视乳头弹性纤维发育进行了研究。他们发现胎儿筛板的细胞层间无弹性蛋白阳性标记，而视乳头周围的巩膜组织却存在大量的弹性蛋白阳性反应并以纤维的形式存在。在新生儿眼筛板的弹性蛋白以微纤维的不规则聚集的刑式存在，与胎儿眼相同乳头周围的巩膜的弹性蛋白也呈强阳性反应。在正常成人，弹性蛋白的长纤维存在于筛板的核心。标记α-elstin(α-弹性蛋白)的电子透明区分布于微纤维间。随着年龄的增长筛板的弹性纤维变得越来越厚形成管样纤维。Quigley对人眼视乳头的光电镜研究结果表明，与其它部位的巩膜相比视乳头周围的巩膜含有更多的弹性蛋白。电镜下观察，弹性纤维的长轴与胶原束平行。在筛板插入巩膜部中央200-300μm区域，弹性纤维形成一个致密环围绕视乳头筛板，起自该环的弹性纤维呈直角进入筛板的筛板束，每条筛板束含有数条弹性纤维，在弹性弹性纤维间有胶原存在。正常人筛板的弹性纤维很直，从一条筛束延伸到到另一条筛束时仅有轻度的弯曲。从视乳头横切面上来看，弹性纤维在各个区分布的差异不大。弹性蛋白与胶原蛋白Ⅳ相互结合使筛板束具有更好的回弹能力，以抵抗由于眼内压力变化或眼球转动引起的牵拉和扭曲。

　　（三）蛋白多糖

　　蛋白多糖是一类复杂的大分子物质，由核收蛋白和氨基葡聚糖支链（GAG）构成，支链以共价健与核心蛋白结合。组织的韧度部分取决于GAG侧链吸附水的能力，与其它蛋白多糖相比，6-硫酸软骨素蛋白多糖在受压状态下不易失水，它的存在使组织更具有弹性特征^[14]。这些大分子可能主要对筛板具有机械支持作用。Sawaguchi等用特殊抗体和选择酶消化法证实，硫酸肝素核心蛋白在基底膜附近呈阳性着染，染色方式与胶原蛋白Ⅳ相同。硫酸软骨素核心蛋白的筛板核心呈丝样阳性着染，染色方式与胶原蛋白Ⅰ相同。不同年龄组两种核心蛋白的染色密度均无明显差异。在筛板核心和与筛板相邻的巩膜基质中有4-硫酸软骨素蛋白多糖和6-硫酸软骨素蛋白多糖，在正常成年筛板中两者的含量基本相同。在老年筛板中4-硫酸软骨素蛋白多糖含量明显的增加，由于其吸附水的能力小于6-硫酸软骨素，因此老年筛板的弹性下降，当眼压升高引起筛板纽曲后，则神经轴突易损性可能增高。

　　（四）吸附因子

　　纤维连接蛋白质和层连接蛋白是糖蛋白中研究的最多的两种分子。这两种分子对于细胞吸附于基底膜上及组织损伤后细胞的吸附和修复均十分重要。纤维连接蛋白结合在细胞，胶原纤维及氨基葡糖支链上，是细胞外基质和细胞间一种特殊的胶水样分子。层连接蛋白是基底膜的主要成分，这种糖蛋白促进上皮或内皮细胞吸附于胶原蛋白Ⅳ上，中枢神经系统的发育及再生中起重要作用。Hernandez^[3-5，8]等的免疫组化研究结果表明，视乳头筛板及插入部无纤维连接蛋白阳性着染，但在视乳头的血管呈强阳性染色，在视神经束膜及蛛网呈弱阳性染色。Goldbaum等的免疫组化法研究结果表明，视乳头筛板及插入部纤维连接蛋白呈阳性着染，在视乳头的血管呈强阳性染色，在视神经束膜及蛛网膜呈弱阳性染色。层连接蛋白阳性染色呈膜样包绕筛板束，其分布形式与胶原蛋白Ⅳ相同。

　　二、开角型青光眼视乳头细胞外基质的改变

　　慢性开角型青光眼视头细胞外基质有明显的改变在并引起组织的重排^[15，16]。Hernandez等^[17]和Morrison等^[10，18]免疫组化及电镜结果均证实，在开角型青光眼病人视乳头基底膜样物质环绕血管并延伸到神经束中，随着病情的加重这种物质在视乳头所占的面积不断增加。进展到大视杯视头筛板前区由基底膜样物质添充。在筛板核心胶原蛋白Ⅳ丝样染色密度明显增加，早中期青光眼的组织学检查发现在筛板和筛板前区有胶质增生，新的基底膜可能就是由这些增生胶质增生，新的基底膜可能就是这些增生胶质细胞合成^[19]，是青光眼弹性蛋白颗粒样聚集物，随着病情的加重，不规则排列的弹性纤维明显增多，无期青光眼表现为视盘边缘弹性蛋白明显丧失。胶原蛋白Ⅵ在许多组织细胞外基质中形成纤维网状结构，与胶原蛋白Ⅰ、Ⅱ相互连接^[21-24]。青光眼病人视乳头特别在筛板束核心胶原蛋白Ⅵ的密度明显增加。提示其可能是筛板组织胶原的反应型。随后Hernandez等^[8]的的超微免疫组化研究结果进一步提示了弹性纤维形态变化。在开角型青光眼筛板的筛束中和插入部存在大量的弹性纤维片断，弹性蛋白样非纤维聚集物和微纤维束。筛板性蛋白成分的这种改变与其它结缔组织疾病的改变类似。Quigley等^[9]用光镜研究了人开角型青光眼及猴实验性青光眼视乳头弹性纤维的改变。他们发现在青光眼早期即在视野出现变化之前筛板部分弹性纤维维由正常直线状态成弯曲正弦曲线状，到青光眼中晚期大部分弹性纤维均发生上述变化。随后。Qugley等^[20]又用电镜对正常人及青光眼病人视乳头筛板的胶原纤维及弹性纤维进行了定量研究，结果发现与巩膜相比正常筛板的胶原纤维直径小且均一，在青光眼筛板中胶原纤维直径是乳头旁巩膜中的4倍，在青光眼筛板中弹性纤维的直径和密度无明显改变。在功能上弹性纤维与胶原纤维是并行承受压力或张力的机械因素^[25]。在低张力水平，胶原纤维易被拉长，大部分压力由弹性纤维承担。在高张力水平，胶原纤维延伸受限，提供强度支持组织。在慢性开解型青光眼中所观察到的胶原纤维密度减少和弹性纤维的明显变化在疾病早期必定引起筛板的机械特性的改变，使筛板承受由增高眼压所引起的张力的能力遭到破坏，这些变化最终导致了发展期青光眼筛板的塌陷，压缩和重建^[15]。

　　青光眼筛板细胞外基质的明显改变说明细胞外基质分子合成或分解酶活性异常。这可能是特殊分子对筛板组织微环境改变的一种反应，而微环境的改变是由机械压迫或血液灌注减少或两种因素共同引发的。

　　三、视乳头细胞外基质的分子生物学研究

　　以上本文复习了近年来关于视乳头筛板细胞外基质的免疫组化的研究结果，这些研究主要从蛋白水平研究了筛板的大分子成分和结构组成，但这些方法不能反映筛板组织对某种蛋白的生物合成，也不能确定合成某种特定蛋白的细胞，随着现代分子生物学技术的发展，目前已有一些学者从分子和细胞水平对正常及慢性长角型青光眼视乳头细胞外基质进行了深入研究。Hernandez等^[26]用原位杂交方法发现正常人视乳头均有细胞编码胶原蛋白Ⅰ、Ⅳ的mRNA。阳性标记细胞的分布与免疫组化观察的蛋白分布结果一致。在筛板前区，胶原束中的成簇的细胞标记胶原蛋白Ⅳ的mRNA表达，这些标记细胞可能是内皮细胞、周围边细胞及环绕血管的星型胶质细胞。胶原束中仅有少量细胞有胶原蛋白Ⅰ的mRNA表达。在筛板区筛板束核心的筛板细胞及衬在筛板束表面的星型胶质细胞均有胶原蛋白Ⅳ的mRNA表达。成人筛板束核心许多细胞有臆造原蛋白Ⅰ的mRNA表达。Ye等^[27]用原位杂交法证实正常人眼视乳头有胶原蛋白Ⅲ的mRNA表达，成人主要是在筛板束核心的细胞中。Yang等^[28]建立了体外筛板细胞外基质培养系统，他们发现如果增高静水压，7天后胶原蛋白Ⅰ的mRNA表达增加，为正常135%-255%，压力引起离体人眼筛板细胞表型变化的机制尚不清楚。Hernandez等^[29]用原位杂及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）研究了慢性开角型青光眼的视乳头，结果发现在与青光眼视杯邻近筛板前区，大部分星形胶质细胞有胶原蛋白Ⅳ的mRNA的转录，他们认为慢性青光眼基底膜样物质可能由星形胶质细胞合成，在筛板仅有少量（胶原纤维酸性蛋白）（GFAP）阴性细胞有胶质原蛋白Ⅳ的表达，这些细胞可能是筛板核心的筛板细胞。在筛板后区衬在神经束膜表现和神经纤维间的胶质细胞胶原蛋白Ⅳ的表达增强，这些结果表明胶质细胞增生及所引起的基底膜合成组织增多是对中枢神经系统轴突损伤的一种普遍反应，Hernandez等^[30]用同样方法对正常人和青光眼病人视乳头细胞外基质的弹性蛋白进行了研究，结果发现青光眼视乳头中有弹性的mRNA表达而正常人中无此表达。合成水平与弹性蛋白mRNA水平一致的。人类几种弹性纤维损害的疾病均表现为弹性蛋白的合成异常和促弹性解离活性增强，使组织的生物力学发生改变^[31，32]。Keeley等^[33，34]在实验性动物高血压模型研究中发现，随着血压增高，血管壁中弹性蛋白mRNA和生物合成水平可暂时升高。血压恢复正常后，合成水平也恢复正常，便血管壁的细胞外基质的变化不会恢复。这说明在正常动脉生长中，血液动力因子控制弹性蛋白的合成及基因表达。弹性纤维是正常视乳头筛板的主要成分，赋予筛板弹性特点。对眼压变化敏感者在眼压升高后可诱发弹性蛋白的异常基因表达或异常合成，导致了慢性青光眼视乳头细胞外基质所发生的改变。

　　四、小结

　　视乳头筛板是一具有弹性的顺应组织、当眼压波动引起急性机械变化时，它可使组织恢复原有状态。正常成年视乳头筛板核心是由大量的弹性纤维、丝网状基底膜物质（包括胶原蛋白Ⅳ、纤维连接蛋白和硫酸肝素蛋白多糖）及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ组成的胶原纤维构成，在胶原纤维中弥漫分布胶原蛋白Ⅴ、Ⅵ，界限清晰连接的基底膜（即星形胶质细胞的基底膜）包绕筛板并将筛板束与星形胶质细胞分开，基底膜线样延伸到筛板核心构成丝网状结构。随着年龄的增长筛板的老化，筛板核心细胞外基质密度逐渐增加。

　　慢性开角型青光眼视乳头筛板细胞外基质发生了明显变化，主要表现核心胶板前及筛板基底膜样物质增生，筛板核心胶原纤维密度板基底模样物质增生，筛板核心胶原纤维密度减少和弹性蛋白非纤维样聚集。病程早期筛板细胞外基质的这些变化使筛板的生物力学特性发生改变，削弱了筛板承受眼压升高所引起的压力的能力，导致病程晚期筛板的塌陷、挤压和重排。眼压升高引起筛板细胞外基质生物合成发生变化的机制以及筛板局部环境因子对这些细胞外基质生物合成的影响将有待于进一步深入研究。

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