P⁵³与妇科恶性肿瘤的基因治疗

　　国外医学妇幼保健分册1999年第10卷第2期

　　白求恩医科大学第二临床学院妇产科（130041）关婷任娟*综述李守柔审校

　　摘要 P⁵³基因异常与肿瘤发生密切相关。将外源性野生型 p⁵³导入妇科恶性肿瘤细胞，在体外及动物实验中均出现了抑制肿瘤细胞生长及使肿瘤细胞出现凋亡的现象，故认为 p⁵³基因治疗妇科肿瘤很有前途。

　　主题词：1. p⁵³基因 2.女性生殖器肿瘤 3.基因疗法

　　基因治疗是80年代发展起来的人类医学分子遗传学中的新领域。发展非常迅速，起初仅用于单基因遗传病的治疗性研究方面，随着对恶性肿瘤的研究在分子水平上取得突破性进展，恶性肿瘤的基因治疗已成为当前研究的热点。 p⁵³基因是至今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，约50%的人类恶性肿瘤中都存在 p⁵³基因的异常。因此在基因治疗的研究中 p⁵³基因的地位十分突出。

　　1． p⁵³基因与肿瘤的关系

　　p⁵³基因位于人的17号染色体短臂1区3带1亚带（17P13.1），全长约20kb。由11个外显子和10个内含子组 p⁵³mRNA长2.8kb，表达产物 p⁵³蛋白是一种磷酸化核蛋白，由393个氨基酸残基组成，分子量为53KD。 p⁵³蛋白在体内以四聚体形式存在，半衰期为20分钟～30分钟，氨基端有一个酸性区域，羧基端含有3个核定位信号，与 p⁵³在细胞核内的积聚有关。野生型 p⁵³是细胞生长的“临控器”，它的主要功能为：①调节细胞生长周期，使细胞停滞在 g₁期；②参与 dNA损伤修复；③参与诱导细胞凋亡。

　　野生型 p⁵³调节细胞周期的作用主要通过两个途径实现。一个途径为野生型 p⁵³与细胞核内特异的 dNA部位结合，结合后通过氨基端的酸性激活区激活邻近基因的启动子，促进基因的表达。受其促进的基因多为细胞增殖的抑制基因，从而抑制细胞增殖。最近发现 p⁵³能启动 wAF₁基因的表达，产生 p²¹。 p²¹广泛抑制细胞周期蛋白与依赖细胞周期蛋白的激酶（ cDK）的复合物，使该复合物的活性丧失，细胞周期停滞于 g₁期，则细胞的增殖受抑制。 p⁵³基因的突变，使其结合 dNA特殊部位及激活邻近基因的功能丧失。因而丧失了抑制细胞增殖的功能，使细胞过度增殖，发生癌变。另一途径为野生型 p⁵³可以对许多缺乏 p⁵³特异结合部位的基因的启动子直接起负调控制作用。受负调控的基因多数是一些与细胞增殖有关的基因。其机理为野生型 p⁵³通过与这些基因的 tATA结合蛋白（ tBP）结合，使 tBP不能与启动子的 tATA盒结合，从而抑制转录的起始。突变的 p⁵³虽仍保留与 tBP结合的能力，却不能阻止 tBP与 tATA盒结合，故丧失抑制转录起始的功效。因此认为 p⁵³基因的突变导致它对某些细胞增殖基因的启动子抑制作用减弱，这也与肿瘤的发生有关。

　　p⁵³基因对维持细胞基因组的稳定起重要作用。当细胞受到射线或某些药物作用而发生 dNA损伤时，野生型 p⁵³能阻止细胞从 g₁期进入 s期，以便细胞有足够的时间修复损伤而恢复正常。如果修复失败，则通过诱发细胞凋亡使细胞自尽，从而保证有癌变倾向的细胞不再继续存活下去。突变的 p⁵³丧失这一功能，使损伤的 dNA不能很好修复，而继续复制，进而发生癌变。

　　除 p⁵³基因发生突变、缺失外， p⁵³蛋白与 dNA肿瘤病毒转化蛋白结合，如 sV₄₀的大 t抗原，腺病毒的 e₁B蛋白，人乳头瘤病毒的 e₆蛋白，也使其失活。 e₆蛋白与野生型 p⁵³蛋白结合还可促使其降解。这可能是一些 dNA肿瘤病毒致癌的机理之一。

　　突变的 p⁵³基因不仅丧失抑制瘤活性而且具有促进恶性转化的作用，可见 p⁵³基因异常与肿瘤发生关系密切。因此将外源性野生型 p⁵³转移入肿瘤细胞中以抑制其恶性表型的研究成为当前的热点，已在前列腺癌、结肠癌及头颈部磷状细胞癌的研究中取得了可喜的成果。在体外及动物实验中出现了抑制肿瘤细胞生长、使肿瘤细胞致瘤性降低及使肿瘤细胞出现凋亡的现象^[1～3]。

　　2．女妇恶性肿瘤的 p⁵³基因治疗

　　45%～80%的卵巢肿瘤伴有 p⁵³异常^[4]。宫颈癌中虽然 p⁵³突变发生率不高，但其 hPV阳性率高达90%^[5]。 hPV的 e₆蛋白能使 p⁵³降解，因此其发生也与 p⁵³有关。子宫内膜癌中有20% p⁵³异常^[6]。可见妇科恶性肿瘤与 p⁵³关系密切。因此一些学者就 p⁵³基因对妇科恶性肿瘤的治疗进行了研究。虽然刚刚起步，但已取得了一定成绩。

　　卵巢癌： santoso等^[7]于1995年用复制缺陷的腺病毒构建了人野生型 p⁵³的表达载体（ adCMV- p⁵³），并证实确有 p⁵³蛋白的表达。用这一表达载体转染人卵巢2774细胞株。经序列分析证实该细胞株 p⁵³基因的第273位密码突变，由 cGT→ cAT。转染结果显示外源性 p⁵³滴度的增加，抑制作用增强。病毒滴度为100PFU/细胞时，能完全抑制肿瘤细胞的生长。 von-Gruenigen-VE^[8]也用 ad-CMV- p⁵³感染2774细胞株，发现同样抑制卵巢癌细胞生长作用但并无特异性， santoso同时用 ad-CMV- p⁵³转染正常人的成纤维细胞，发现对该细胞生长无抑制作用。 drgzan等也发现外源性 p⁵³不影响正常肝细胞的功能再生能力。说明外源性 p⁵³只对 p⁵³突变的肿瘤细胞起抑制作用，而对正常细胞无影响。这对用外原性 p⁵³进行基因治疗非常有利^[9]。 mujoo等^[10]于1996年用 ad-CMV- p⁵³转染人卵巢癌 sKOV-3细胞株（该细胞 p⁵³基因缺失）。结果抑制了该细胞的克隆形成能力。将已转染 p⁵³的 sKOV-3细胞注入祼鼠体内，提高了祼鼠生存率50%。 p⁵³基因治疗的荷瘤祼鼠中有4支长期生存者，生存期为66天，120天、166天和423天。充分显示了 p⁵³基因治疗的有效性。 nielsen LL^[11]也对 p⁵³阴性的 sKOV-3细胞进行了 p⁵³基因转染，获得了同样的治疗效果。他同时还发现 p⁵³的基因治疗可与卵巢癌的紫杉醇类化疗药物产生协同作用^[12]。

　　宫颈癌： hamada等^[13]于1996年用 ad-CMV- p⁵³转染八个人宫颈癌细胞株。其中六个细胞株 hPV（+）， p⁵³基因正常，但细胞内未检测到 p⁵³蛋白，认为是 hPV的 e₆蛋白使 p⁵³降解；二个细胞株 hPV（-），出现 p⁵³基因突变。转染后6小时在细胞核内出现明显的 p⁵³蛋白染色，第三天达高峰。转染后15天 p⁵³蛋白的表达仍高于水转染细胞。向祼鼠体内注入 p⁵³基因， p⁵³蛋白表达持续15天。说明外源性 p⁵³基因在体内外可以有效表达。 p⁵³转染的宫颈癌细胞的生长受到明显抑制。外源性 p⁵³使宫颈癌细胞的致瘤性明显下降。他们向宫颈癌祼鼠模型的肿瘤中单次及多次注射外源性 p⁵³，发现多次注射抑制啃瘤生长作用更强，在六次注射组中有二支鼠肿瘤完全消失。他们还对 p⁵³抑制肿瘤细胞生长的机理作了探讨，发现在 p⁵³感染后24小时48小时，部分肿瘤细胞出现细胞凋亡的前奏变化，细胞变圆，外膜有小泡，感染后36小时，出现凋亡核的的 dNA片断。认为 p⁵³抑制肿瘤的作用是由于诱发肿瘤细胞凋亡。

　　子宫内膜癌：尚示见将外源性 p⁵³导入内膜癌细胞的报道。

　　3．基因转移方法

　　基因转移方法有物理、化学及生物学方法。以病毒为载体的生物方法应用最广，可用于体外及体内实验。以往多用逆转录病毒。但逆转录病毒只能感染分裂复制的细胞，对高分化而不分裂的细胞不能感染，且滴度较低。更主要的是逆转录病毒能整合入基因组中，有引起插入性突变的可能。目前认为腺病毒做载体更具优越性。腺病毒是一种 dNA双链无包膜病毒，基因组 dNA约36KD，可编码14种蛋白质。该病毒有以下优点：①对人类安全，无致畸、致病及致癌性；②对分裂细胞及颈癌细胞株的转染效率达到90%～100%；③腺病毒感染细胞时 dNA不整合到宿主细胞染色体中。因而无潜在激活原癌基因或使抑癌基因失活的危险；④腺病毒容易制备、纯化和浓缩，可达到较高滴度；⑤腺病毒载体可插入7.5kb的外原基因，容量较大，所以目前国外多用复制缺陷的腺病毒为载体介导 p⁵³基因转移。

　　4．目前存在的问题

　　p⁵³基因治疗的研究虽然取得了一定的成绩，也存在不少问题。最突出的问题为抗体的产生。病毒载体均可引起抗体产生。腺病毒能引发强烈的免疫反应，在第一次感染后两周内恒河猴血浆中的抗腺病毒体滴度升高^[14]。由于抗体的产生，腺病毒为载体的基因导入难以长期应用。其次肿瘤是一种多基因异常的疾病，仅纠正 p⁵³异常能否达到治愈的目的尚需研究。另外目前基因导入后，都领先某些外源的启动子而表达，无法进行调控。

　　总之，用外源性 p⁵³基因治疗妇科恶性肿瘤很有前途。相信随着研究的不断深入，它将在肿瘤治疗中发挥巨大作用。

　　*西安医科大学第一临床医学院（710061）

　　主要参考文献

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校对时间：2000-03-09李慧利