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苯胺类化合物对肝细胞毒性的定量结构-活性关系研究
卫生毒理学杂志 1999年第1期第13卷 论著
作者：牛静萍 赵晓红
单位：牛静萍 (兰州医学院环境卫生教研室 730000)； 赵晓红 (兰州大学生物系博士生)
关键词：定量结构-活性关系(QSAR)；大鼠游离肝细胞；拓扑学指数；细胞毒性
内容摘要 以大鼠游离肝细胞半数中毒浓度(TC50)和细胞逸出酶(SDH和LDH)为观察指标，研究了25种苯胺类化合物的肝细胞毒性，并利用这些毒性效应数据为因变量，以这些化合物的10种拓扑学指数为自变量，利用多元逐步回归统计分析方法进行了定量结构-活性关系(QSAR)的深入探讨。结果表明，化合物的结构不同则毒性不同，3个QSAR方程中影响毒性的主要结构参数有分子连接性指数0xv、1xv,2xv、3xvc和分子负熵I。实验得出的3个QSAR方程能够较好地预测苯胺类化合物的毒性。
Cytotoxicity and quantitative structure-activity relationships (QSAR) of aminobenzene derivatives to rat hepatocytes
Niu Jing-ping(Lan zhou Medical College，730000)
Zhao Xiao-hong
This study investigated toxicity of 25 aminobenzene derivatives with cellular median toxic concentration(TC50) of isolated rat hepatocytes and enzymes(SDH and LDH) leaked from hepatocytes.These toxic data(TC50,SDH and LDH) were used as dependent variable and 10 topological indices of 25 aminobenzene derivatives were used as independent variable.QSAR was analyzed with multiple stepwise linear regression.The results indicated that there is different toxicity with different structure of compounds.The principal structure parameters in three QSAR equations to affect hepa-to toxicity were molecular connectivity indices(0XV，1XV，2XV，3XVC) and molecular negentropy(Ⅰ).Three equations obtained in this paper could predict the toxicity of aminobenzene derivatives.
Key words:quantitative structure-activity relationships(QSAR);isolated rat hepatocytes;topological indices; cytotoxicity.
随着科学技术和工农业生产的高速发展，定量结构-活性关系(QSAR)是根据有机化合物的分子结构、理化性质和生物学活性，以一定的数学模式，定量地描述它们之间的关系，其目的是预测有机化合物的生物活性。苯胺类化合物在化学、国防、医药等工业方面有广泛的应用，近年来新合成的此类化合物不断增加，仍有许多尚未进行毒理学实验。
本研究采用大鼠游离肝细胞，以化合物对肝细胞毒性的3项指标(TC50、LDH、SDH)作为因变量，以反应分子结构特征的分子连接性指数和分子负熵作为自变量，进行逐步回归分析，以获得结构-活性“最优”数学模式，并用模式预测了3种苯胺类同系物对肝细胞的毒性。
材料与方法
1.受试物：受试物为25种苯胺类化合物(表1)。受试物均用二甲基亚砜溶解，pH调至7.2～7.4，配制5种不同浓度的母液备用。
表1 28种苯胺类化合物、结构式、规格
| 编号 |
化合物 |
结构式 |
规格 |
编号 |
化合物 |
结构式 |
规格 |
| 1 |
苯 胺 |
 |
A.P. |
11 |
2,6-二氯苯胺 |
 |
L.P. |
| 2 |
邻甲苯胺 |
 |
A.P. |
12 |
间溴苯胺 |
 |
C.P. |
| 3 |
间甲苯胺 |
 |
C.P. |
13 |
邻硝基苯胺 |
 |
C.P. |
| 4 |
对甲苯胺 |
 |
A.P. |
14 |
间硝基苯胺 |
 |
C.P. |
| 5 |
N，N-二甲基苯胺 |
 |
C.P. |
15 |
对硝基苯胺 |
 |
C.P. |
| 6 |
N-乙苯胺 |
 |
A.P. |
16 |
2,4-二硝基苯胺 |
 |
A.P. |
| 7 |
N,N-二甲基
-1,4-苯二胺 |
 |
A.P. |
17 |
4-氯-2-硝基
苯胺 |
 |
L.P. |
| 8 |
N,N-二乙基
-1,4-苯二胺 |
 |
C.P. |
18 |
间-硝基二甲
基苯胺 |
 |
E.P. |
| 9 |
对苯二胺 |
 |
L.R. |
19 |
2,4-二硝基二苯胺 |
 |
C.P. |
| 10 |
邻氯苯胺 |
|
C.P. |
| 20 |
对-亚硝基二甲
基苯胺 |
 |
C.P. |
25 |
对氨基苯磺酸 |
 |
A.R. |
| 21 |
N-亚硝基二苯胺 |
 |
L.R. |
26 |
1-硝基-2,4-苯二胺 |
 |
C.P. |
| 22 |
对乙氧基苯胺 |
 |
C.P. |
27 |
N-乙酰基-对
乙氧基苯胺 |
 |
A.R. |
| 23 |
4-硝基-2-氨基酚 |
 |
L.R. |
28 |
2,6-二氯对硝
基苯胺 |
 |
L.R |
| 24 |
乙酰基乙酰基
苯胺 |
 |
C.P. |
*用QSAR模式预测其毒性的苯胺类同系物
2.动物选择及游离肝细胞的制备：
选用健康雄性SD大鼠，体重在150～200g，大鼠游离肝细胞的制备采用黄俊勇［1］等人改进的方法，细胞存活率在90%以上者用于实验，细胞浓度调至5×105个/ml培养液，备用。
3.细胞毒性观察指标及测定方法：
(1)细胞半数中毒浓度(TC50)的测定：将细胞悬液分装到细胞培养板，每孔1.5ml，在测试组每孔加入10μl备用的受试物，设5个不同剂量组和对照组，染毒后混匀，于饱和湿度，5%CO2培养箱中37℃培养2小时，之后用苔盼蓝染色、计数，计算细胞存活率和死亡率，根据细胞死亡率用概率单位法计算细胞半数中毒浓度(TC50)及其负对数(PTC50)。
(2)细胞逸出酶活性测定：用上述25种化合物TC50的1/10浓度对细胞进行染毒，于饱和湿度、5%CO2培养箱中37℃培养2小时后，200r/min离心5分，取上清液分别测定乳酸脱氢酶(LDH)和山梨醇脱氢酶(SDH)活性，并分别计算各自的负对数。LDH测定用2,4-二硝基苯肼显测法。SDH测定用间苯二酚显色法［2］。
4.受试物理论参数的计算：
目前，在QSAR研究中，理论参数有两部分：理化参数和拓扑学参数。我们选用拓扑学参数，其中有：
(1)分子连接性指数(mxvt)：分子连接性指数是表征分子结构特征的拓扑学指数中最常用的参数之一，其计算公式如下：
 ［3］
式中nm是价为m的t类型子图的数目，v表示分子结构中含有杂原子，si为第i个非氢原子的点价。
(2)分子负熵：分子负熵作为一种表征分子结构信息的参数可将分子影响其生物活性的突出结构特征译制出来，其计算公式如下：
 ［4］
式中N为分子中原子总数，K为常数，Pi为某种组合的原子的随机选择机率。
5.QSAR模式的建立：
将TC50、SDH、LDH进行负对数变换后，分别作为因变量Y1,Y2,Y3。以苯胺为基本结构计算出的9种分子连接指数和分子负熵作为自变量，进行多元逐步回归分析，以确定最优定量结构-活性模式，同时筛选出与细胞毒性关系最为密切的参数。
结 果
1.理论参数计算及细胞毒性测定结果：
25种受试物和3种被预测的苯胺同系物的拓朴学指数计算，分别测定每个受试物的TC50、SDH和LDH，并计算各自的负对数Y1,Y2,Y3，结果列于表2。
表2 28种苯胺类化合物的拓扑学指数与生物活性
| 编号 |
化合物名称 |
分子连接性指数 |
分子负熵
I |
生物活性 |
| 0χv |
1χv |
(1χv)2 |
2χv |
(2χv)2 |
3χvp |
3χvc |
4χvp |
4χvpc |
Y1 |
Y2 |
Y3 |
| 1 |
苯胺 |
3.964 |
3.155 |
9.954 |
3.736 |
13.958 |
2.206 |
0.913 |
1.701 |
1.522 |
13.035 |
-3.085 |
-1.043 |
-2.210 |
| 2 |
邻甲苯胺 |
4.887 |
3.533 |
12.480 |
4.278 |
18.301 |
2.933 |
1.212 |
2.043 |
2.566 |
18.884 |
-3.044 |
-1.089 |
-2.273 |
| 3 |
间甲苯胺 |
4.887 |
3.521 |
12.395 |
4.380 |
19.185 |
2.636 |
1.344 |
2.236 |
2.155 |
18.884 |
-2.469 |
-1.626 |
-2.848 |
| 4 |
对甲苯胺 |
4.887 |
3.521 |
12.395 |
4.373 |
19.123 |
2.706 |
1.341 |
2.003 |
2.261 |
16.476 |
-2.681 |
-1.462 |
-2.636 |
| 5 |
N，N-二甲基苯胺 |
5.834 |
3.984 |
15.872 |
4.518 |
20.412 |
2.894 |
1.071 |
2.222 |
2.245 |
18.341 |
-1.703 |
-1.848 |
-3.002 |
| 6 |
N-乙苯胺 |
5.594 |
4.177 |
17.444 |
4.199 |
17.634 |
2.637 |
0.874 |
2.198 |
1.642 |
21.579 |
-2.480 |
-1.606 |
-2.837 |
| 7 |
N，N-二甲基-1,4-苯二胺 |
6.334 |
4.139 |
17.129 |
4.789 |
22.932 |
3.113 |
1.288 |
2.322 |
2.624 |
21.252 |
-1.236 |
-2.042 |
-3.147 |
| 8 |
N，N-二乙基-1，4-苯二胺 |
7.748 |
5.291 |
27.995 |
5.066 |
25.670 |
3.649 |
1.176 |
2.919 |
2.523 |
29.229 |
-0.788 |
-2.177 |
-3.266 |
| 9 |
对苯二胺 |
4.464 |
3.309 |
10.952 |
4.007 |
16.056 |
2.425 |
1.129 |
1.791 |
1.900 |
10.837 |
-2.399 |
-1.637 |
-2.918 |
| 10 |
邻氯苯胺 |
5.091 |
3.635 |
13.210 |
4.439 |
19.703 |
3.118 |
1.296 |
2.150 |
2.844 |
15.444 |
-2.385 |
-1.660 |
-2.932 |
| 11 |
2，6-二氯苯胺 |
6.217 |
4.108 |
16.880 |
5.203 |
27.074 |
3.769 |
1.771 |
2.945 |
3.800 |
13.035 |
-2.311 |
-1.698 |
-3.006 |
| 12 |
间溴苯胺 |
5.871 |
4.013 |
16.102 |
5.232 |
27.378 |
3.248 |
1.836 |
2.943 |
2.921 |
15.444 |
-2.081 |
-1.783 |
-3.050 |
| 13 |
邻硝基苯胺 |
5.111 |
3.737 |
13.964 |
4.265 |
18.194 |
2.788 |
1.096 |
2.188 |
2.083 |
18.664 |
-2.651 |
-1.478 |
-2.736 |
| 14 |
间硝基苯胺 |
5.111 |
3.725 |
13.874 |
4.322 |
18.677 |
2.701 |
1.178 |
2.122 |
2.122 |
18.664 |
-2.808 |
-1.380 |
-2.509 |
| 15 |
对硝基苯胺 |
5.111 |
3.725 |
13.876 |
4.315 |
18.616 |
2.745 |
1.175 |
2.040 |
2.183 |
16.256 |
-2.791 |
-1.412 |
-2.526 |
| 16 |
2，4-二硝基苯胺 |
6.259 |
4.307 |
18.550 |
4.851 |
23.533 |
3.301 |
1.377 |
2.522 |
2.835 |
21.993 |
-2.412 |
-1.609 |
-2.904 |
| 17 |
4-氯-2-硝基苯胺 |
6.238 |
4.205 |
16.201 |
5.086 |
25.866 |
3.363 |
1.645 |
2.667 |
3.047 |
18.664 |
-2.268 |
-1.760 |
-2.971 |
| 18 |
间-硝基二甲基苯胺 |
6.981 |
4.554 |
20.740 |
5.103 |
26.045 |
3.395 |
1.336 |
2.594 |
2.852 |
24.262 |
-1.607 |
-1.908 |
-3.026 |
| 19 |
2，4-二硝基二苯胺 |
8.991 |
7.096 |
50.348 |
8.084 |
65.351 |
5.420 |
1.930 |
4.392 |
3.943 |
38.112 |
-2.328 |
-1.681 |
-2.989 |
| 20 |
对-亚硝基二甲基苯胺 |
6.573 |
4.387 |
19.250 |
4.877 |
23.785 |
3.288 |
1.237 |
2.460 |
2.705 |
20.087 |
-1.564 |
-1.998 |
-3.123 |
| 21 |
N-亚硝基二苯胺 |
8.037 |
6.695 |
44.825 |
7.758 |
60.188 |
5.091 |
1.771 |
4.052 |
3.453 |
23.509 |
-1.766 |
-1.950 |
-2.990 |
| 22 |
对乙氧基苯胺 |
6.002 |
4.220 |
17.813 |
4.294 |
18.435 |
2.706 |
1.045 |
2.149 |
1.900 |
22.723 |
-2.324 |
-1.704 |
-2.994 |
| 23 |
4-硝基-2-氨基酚 |
5.481 |
3.826 |
14.642 |
4.428 |
19.605 |
2.934 |
1.263 |
2.134 |
2.502 |
20.316 |
-2.667 |
-1.487 |
-2.650 |
| 24 |
乙酰基乙酰基苯胺 |
7.410 |
5.390 |
29.048 |
5.858 |
34.310 |
3.115 |
1.550 |
2.620 |
1.949 |
28.683 |
-3.012 |
-1.016 |
-2.100 |
| 25 |
对氨基苯磺酸 |
5.679 |
4.384 |
19.222 |
5.429 |
29.473 |
3.344 |
1.942 |
2.500 |
3.200 |
18.982 |
-3.191 |
-1.040 |
-2.226 |
| *26 |
1-硝基-2,4-苯二胺 |
5.611 |
3.886 |
15.097 |
4.569 |
20.876 |
2.922 |
1.369 |
2.316 |
2.516 |
21.391 |
| *27 |
N-乙酰基-对乙氧基苯胺 |
7.833 |
4.340 |
18.837 |
5.297 |
28.061 |
3.098 |
1.335 |
2.670 |
2.082 |
30.916 |
| *28 |
2，6-二氯对硝基苯胺 |
7.364 |
4.679 |
21.893 |
5.796 |
33.594 |
4.186 |
2.055 |
3.440 |
4.241 |
16.256 |
1.*为用QSAR模式预测其毒性的苯胺同系物
2.Y1为PTC50(TC50的负对数)，Y2为PSDH(SDH)的负对数，Y3为PLDH(LDH的负对数)。
2.QSAR方程的分析：
经多元逐步回归分析，筛选出3个最具有代表性的QSAR方程，结果列于表3。表3归纳了25种苯胺类化合物结构与生物活性间的统计学相互关系。3个方程均引入了0χv、1χv、2χv和3χvc4个分子连接指数和分子负熵I，说明对3个生物活性指标来说，这5个指标都具有非常重要的意义。
表3 25种苯胺类化合物的QSAR
| QSAR方程式 |
n |
r |
s |
Fa |
 |
25 |
0.818 |
0.380 |
8.060 |
 |
25 |
0.783 |
0.216 |
6.343 |
 |
25 |
0.741 |
0.237 |
4.852 |
1.a：F0.05(NULL,35-5-1)=4.18。
2.C1:TC50,C2:SDH,C3:LDH。
3.n：化合物总数，r：复相关系数，s：剩余标准偏差。
3.苯胺同系物毒性的预测：
我们选择了未参与建立QSAR方程的3种苯胺同系物(表1中26～28号化合物)，按前文述及的方法计算其理论参数(结果见表2)，应用本研究获得了3个QSAR方程分别计算其对肝细胞毒性理论值，然后对按前述实验方法实际测定了这3种化合物对肝细胞的毒性大小，结果见表4。从表4结果看出，实际测定的生物活性值与理论预测值非常接近，说明本研究获得的苯胺类化合物对大鼠游离肝细胞毒性的3个QSAR方程能够较准确地预测苯胺同系物的毒性大小。
表4 三种苯胺同系物的预测结果
| 编号 |
化合物 |
log1/TC50 |
log1/SDH |
log1/LDH |
| OBS |
EST |
OBS |
EST |
OBS |
EST |
| 1 |
1-硝基-2,4-苯二胺 |
-2.380 |
-2.492 |
-1.492 |
-1.581 |
-2.611 |
-2.780 |
| 2 |
N-乙酰基-对乙氧基苯胺 |
-2.924 |
-2.760 |
-1.550 |
-1.459 |
-2.974 |
-2.760 |
| 3 |
2，6-二氯对硝基苯胺 |
-2.001 |
-2.165 |
-2.121 |
-1.927 |
-2.903 |
-3.260 |
OBS为实验观测值，EST为理论预测值
讨 论
近年来，已有报道将游离肝细胞系统用于筛选肝毒性的化学物质［5］。国内外的研究也都表明，某些具有相似化学结构的物质对游离肝细胞的毒性大小与其在体内实验中表现的急性毒性高度相关［6，7］。我们采用新鲜游离肝细胞，对苯胺类化合物的急性毒性进行了体外研究，并作了定量结构-活性关系的分析。
有机化合物的毒性与其化学结构有着极为密切的关系，化合物产生毒性是由其化学结构决定的，改变化合物的结构将导致其毒性的改变。本研究表明，随着在母体化合物上引入不同的化学基团，其毒性大小有明显的差异，例如，凡是在苯环上引入-NR基团的化合物，其毒性显著高于其它同系物。其次，在苯环上引入-Br,-Cl等卤族原子以及-NH2、-OC2H5等基团，毒性也较大。本研究获得的3个方程显示了苯胺类化合物的拓扑学指数与其毒效应之间的关系，3个方程都引入了能够定量地描述化合物分子中原子组成和排列的0χv,1χv或(1χv)2,(2χv)2以及3χvc等四种分子连接性指数。这几个指标分别反映化合物中侧链的类别和位置及取代基的数目和种类，说明了化合物分子结构和毒效应的关系。另外，3个方程中均引入了分子负熵I，化合物分子结构和各部分愈不对称，则分子负熵愈大，毒性也愈大。
我们借助本研究获得的3个QSAR模式，实际预测了3种苯胺同系物的毒性大小，并通过实验证明了毒性观测值与理论预测值相当接近。因此，我们认为，本研究获得的氨基苯类化合物对大鼠游离肝细胞毒性的3个QSAR模式，能够较准确地预测同系物的毒性大小。
参考文献
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5.Story DL，et al．Response of isolated hepatocytes to organic and inorganic cytotoxins．J Toxicol Environ Health．1983,11:483.
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(修回日期 1998年6月)
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