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α-颗粒膜蛋白在猪皮肤撕脱伤血栓形成中的作用
第四军医大学学报1999年第20卷第11期
李向东 鲁开化 郭树忠 高政慧
摘 要 目的：探讨皮肤撕脱伤后α-颗粒膜蛋白的变化及在血栓形成中的作用．方法：①体内部分：将猪分成对照组和实验组，采用放免法测定血小板表面和血浆中α-颗粒膜蛋白的含量．②体外部分：离体培养人脐静脉内皮细胞，通过放免法测定组胺作用下内皮细胞与白细胞之间的粘附力及GMP-140单抗对其影响．结果：皮肤撕脱伤后猪血小板表面及血浆中α-颗粒膜蛋白含量增加（P＜0.05），内皮细胞与白细胞的粘附力因α-颗粒膜蛋白含量的增加而增加，但可以被GMP-140单抗消除．结论：皮肤撕脱伤后血中α-颗粒膜蛋白的含量增加参与了撕脱后早期血栓的形成．
关键词：α-颗粒膜蛋白 皮肤 撕脱伤 细胞培养
α-颗粒膜蛋白（P-Selectin Ps，又称GMP-140或P-选择素）为血小板内含量丰富的物质，内含多种与血小板功能相关的生物活性物质，它也存在于内皮细胞的Weibel-palade小体中，当被炎性介质、缺血再灌后氧自由基增多的刺激下，颗粒释放，并导致GMP-140快速转位到细胞表面表达，在血小板活化、粘附中起关键作用［1］．通过测量皮肤撕脱伤后GMP-140的变化，了解其在撕脱伤继发血栓形成中的作用．
1 材料和方法
1.1 体内部分
1.1.1 动物模型与分组 选用检疫后小猪10头，体质量15 kg～25 kg，随机分成2组：A对照组，4头，即在实验组撕脱皮瓣的相应位置，形成未撕脱相同大小的皮瓣;B实验组，6头，即将猪后肢放置于本科研制的皮肤撕脱伤模型机中，形成不完全皮肤撕脱，并在撕脱区形成蒂在近端12cm×4 cm的撕脱皮瓣.
1.1.2 血标本的采集和处理 两组小猪分别于术前0.5，1，3，6及24 h用塑料注射器抽取静脉血2 mL，以1∶9(V/V)20 g/L EDTA-Na2抗凝．血小板表面GMP-140检测的准备：取0.5 mL抗凝血与等量的固定剂（20 mmol/L戊二醛，3 mmol/L叠氮钠，PBS pH 27.4）混合，室温作用30 min，即为固定的全血，备检；血浆中GMP-140测量前的准备：将抗凝血以3000 r/min室温离心30min，上层血浆分装，-30℃保存待测．以放免技术测量血小板和血浆中GMP-140的含量（放免试剂盒由江苏医学院血栓与出血研究所提供）．
1.2 体外部分
1.2.1 细胞培养及白细胞提取 内皮细胞（EC）按Jaffe等方法用0.5 g/L胶原酶（Ⅰ型，Sigma公司出品）从脐静脉中消化分离，用含200 mL/L 胎牛血清的DMEM（内含VEGF）培养，实验前荧光染色法鉴定EC．以Ficoll-400(Sigma公司出品)，2000 r/min 15 min离心，从健康人血中提取白细胞，并将白细胞用PBS调整密度为1×104/L，51Cr标记后,放入-20℃冰箱备检．
1.2.2 分组及白细胞与EC粘附力的测定 分2组: 对照(A)组，即EC+51Cr标记的白细胞;实验(B)组：即EC+51Cr标记的白细胞+组胺（10 mL）;预处理(C)组：即GMP-140单抗预处理后的EC+51Cr标记的白细胞+组胺（10 mL/L）中进行．白细胞与EC粘附力测定的方法：用1640培养液冲洗融合EC2～3次，加入51Cr标记的白细胞(按1∶5比例），并轻轻吹打使其充分接触1 min，然后放入孵箱1 h，孵育后未粘附的细胞被收集，并用1640培养液冲冼2～3次后，粘附的细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化后收集，放免法测量放射总量，未粘附的细胞量和粘附的细胞量．结果用粘附率表示，即粘附率={(放射总量-未粘附的细胞量)/放射总量}×100%或{粘附细胞量/放射总量}×100%．
2 结果
2.1 体内部分 对照组血小板表面α-颗粒稍高于正常水平，而实验组撕脱伤后即时就明显高于正常水平，为(1563±737)个/血小板，30 min后达到最高值，为(2561±1036)个/血小板，以后仍维持在较高水平，24 h后血小板表面的α-颗粒膜蛋白下降开始明显(Tab 1)．血浆中的α-颗粒膜蛋白含量变化与血小板表面的α-颗粒膜蛋白变化情况基本相似，实验组与对照组比较相差显著(P＜0.05，Tab2)．
表1 猪皮肤撕脱伤后血小板表面α-颗粒膜蛋白数量变化
tab 1 GMP-140 number on platelets surface after avulsion in pigs (No./platelets，X±s)
| Group |
Preoperation |
t(after avulsion)/h |
| 0 |
0.5 |
1 |
3 |
24 |
| Control |
925±498 |
989±594 |
1148±682 |
1105±643 |
1103±617 |
1034±597 |
| Experiment |
912±496 |
1563±737 |
2561±936a |
2329±895a |
1845±826 |
1351±695 |
aP＜0.05 control vs experiment.
表2 猪皮肤撕脱伤后血浆中α-颗粒膜蛋白的含量变化
tab 2 Plasma GMP-140 contents after avulsion in pigs (μg/L，X±s)
| Group |
Preoperation |
t(after avulsion)/h |
| 0 |
0.5 |
1 |
3 |
24 |
| Control |
10.6±2.8 |
11.3±3.1 |
11.2±2.9 |
10.9±2.8 |
10.8±3.1 |
10.7±3.0 |
| Experiment |
10.4±2.9 |
12.5±3.1 |
15.9±3.5 |
15.6±3.3a |
13.3±3.5 |
11.0±3.1 |
P＜0.05 control vs experiment.
2.2 体外部分 对照组平均粘附率为(29.5±5.6)%,而实验组平均粘附率为(36.5±7.3)%，两者相差显著（P＜0.05）,说明α-颗粒膜蛋白的增高可增加白细胞与内皮细胞之间的粘附能力．而经过预处理后的白细胞与内皮细胞之间的粘附能力明显下降．
3 讨论
α-颗粒膜蛋白是细胞粘附分子中选择素家族中的一员，位于巨核细胞、血小板表面以及内皮细胞Weibel-palade小体膜上，当炎症、组胺和氧自由基等刺激后，GMP-140随α-颗粒内容物的释放而与质膜融合，能持久存在于活化血小板质膜表面，在血小板活化、粘附中起关键作用，又在白细胞、单核细胞游走内皮，维持其在内皮游动，最终粘附于内皮细胞过程中起着决定性作用．α-颗粒膜蛋白在多种疾病中都有变化，如急性心肌梗塞、脑血栓形成、哮喘发作、体外循环等［2］．有关白细胞与内皮细胞粘附力的报道，Hamburger等［3］认为GMP-140参与了白细胞与被激活的内皮细胞之间的粘附，但这种活动是Ca2+依赖性的，同时也参与了白细胞与血小板之间的粘附．目前较多资料支持的看法是，GMP-140介导了白细胞对内皮细胞快速、短暂的粘附反应，数十分钟可达高峰，因此又称速发反应．而α-颗粒膜蛋白在创伤，特别是皮肤撕脱伤中含量变化如何？以及在皮肤撕脱伤后血栓形成中的作用知道甚少．
皮肤撕脱伤分原发性坏死和继发性坏死．继发性坏死主要原因是血栓的形成．从本实验的结果可知，猪皮肤撕脱伤后由于缺血再灌、氧自由基和炎症性介质的作用，血小板表面α-颗粒膜蛋白明显增加（P＜0.05），血浆中的α-颗粒膜蛋白的含量也随血小板表面的表达及血小板的破坏而增加，这就为皮肤撕脱伤后早期血栓的形成创造了条件，而α-颗粒膜蛋白介导的白细胞与内皮细胞的粘附又是速发反应，因此α-颗粒膜蛋白在皮肤撕脱伤血栓形成中可能起着诱导作用．从离体的内皮细胞与白细胞的粘附力测定得知，也证实了在α-颗粒膜蛋白的含量增多的情况下两者之间的粘附力增加．通过对α-颗粒膜蛋白作用的深入了解，对于治疗皮肤撕脱伤后早期血栓形成所致的坏死将有进一步的帮助．
基金项目:国家自然科学基金资助项目 N0．39470705作者简介：李向东，男，1963-11-04生，河北省秦皇岛市人，汉族．1993年第四军医大学整形外科专业硕士毕业，主治医师，九七级该专业博士生，发表论文5篇．导师鲁开化．电话：(029)3375305作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心，陕西 西安710033
参考文献
1 Larsen E，Cell A，Gilbert GE et al．PADGEM protein: A receptor that mediates the interactions of activated platelets with neutrophils and monocytes．Cell，1989;59(3):305-309
2 吴国新，李建勇，李佩霞 et al．血小板表面及血浆内α-颗粒膜蛋白的放射免疫测定．中华血液学杂志，1992;13(2):99-101
3 Hamburger SA，McEver RP．GMP-140 mediates adhesion of stimulated platelets to neutrophils．Blood,1990;75(3): 550-554
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