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HLA-B2704转基因小鼠自发性前葡萄膜炎
中华风湿病学杂志 2000年第4期第4卷 论著
作者：丁海明 吕厚山 蒋东芳 陈占昆
单位：丁海明(100044 北京大学人民医院关节病研究所)；吕厚山(100044 北京大学人民医院关节病研究所)；蒋东芳(100044 北京大学人民医院关节病研究所)；陈占昆(100044 北京大学人民医院关节病研究所)
关键词：小鼠，转基因；葡萄膜炎，前；HLA-B27抗原
【摘 要】 目的 观察HLA-B2704转基因小鼠葡萄膜炎发病情况和糖皮质激素治疗的初步疗效。方法 应用PCR、斑点杂交、Southern杂交、免疫组织化学和流式细胞术进行阳性动物筛选和表达检测。隔日观察眼部症状，可疑动物行眼底镜以及裂隙灯检查，眼球组织切片行HE染色，房水行细胞计数和分类统计。结果 部分HLA-B2704转基因阳性鼠出现明显畏光，眼科检查发现角膜后沉淀。病理发现角膜上皮细胞增生，排列紊乱。房水总细胞数增加，炎性细胞与总细胞数之比为9.24%。正常对照比值为0.75%。χ2检验显示二者差异存在显著性，P＜0.05。地塞米松治疗可以减轻症状，停药后症状加重。符合前葡萄膜炎诊断。结论 首次在转基因小鼠观察到类似人的HLA-B27相关性前葡萄膜炎。
Spontaneous acute anterior uveitis in HLA-B2704 transgenic mice
DING Haiming,Lü Houshan,JIANG Dongfang,et al.
Arthritis Institute,People′s Hospital,Beijing University,Beijing 100044,China
【Abstract】 Objective To observe eye disorders in HLA-B2704 transgenic mice and the effect of dexamethasone.Methods PCR,dot blot,Southern blot,immunohistochemistry and flow cytometry examinations were used to confirm the integration and expression of HLA-B2704 gene.Funduscopy and histopathology of the eyes were performed.Cells in aqueous humour were counted and classified.Results Some of the HLA-B2704 positive mice developed spontaneously acute anterior uveitis and skin involvement.Pathology showed that the cells in cornea increased in number and lined irregularly.The ratio of inflammatory cells in aqueous humour increased significantly (P＜0.05).Conclusion Acute anterior uveitis is first observed in HLA-B2704 transgenic mice model.
【Key words】 Mice,transgenic; Uveitis,anterior; HLA-B27 antigen
HLA-B27与许多自身免疫性疾病存在较强的相关性，临床上常见疾病包括：强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，阳性率＞90%)、瑞特综合征(Reiter′s syndrome，79%～90%)、前葡萄膜炎(acute anterior uveitis，70%)、银屑病性脊柱炎(psoriatic spondylitis，60%～70%)、炎性肠病合并脊柱炎(inflammatory bowel diseases with spondylitis，50%～60%)。尽管HLA-B27在上述疾病发病中的确切作用机制尚不清楚，但在关节炎、肠道炎症和皮肤损害疾病中的意义已经为转基因小鼠模型所证实。在啮齿类HLA-B27转基因小鼠尚没有观察到虹膜睫状体炎。我们已经建立了转HLA-B2704的动物模型［1］，并且发现部分转基因小鼠患有虹膜睫状体炎，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物：转HLA-B2704小鼠为我中心制备。首建转基因阳性鼠(founder)间交配获得F1代，姊妹间交配获得F2代。实验动物包括首建转基因小鼠、F1和F2代。
1.2 阳性动物检测：详见文献［1］：①目的基因整合和拷贝数检测：主要包括：鼠尾DNA提取后，经PCR两对引物初筛，进一步采用斑点杂交和Southern杂交鉴定，探针为6.5 kb HLA-B2704基因，碱性磷酸酶直接标记和检测试剂盒购于Amersham公司。②阳性动物表达检测：剪鼠尾取血，溶解红细胞获得外周血淋巴细胞。应用免疫组织化学和流式细胞术检测目的DNA表达水平，一抗为HC10抗体(抗HLA-B27重链特异单抗，由美国哈佛医学院病理和免疫学教授Ploegh惠赠)和HLA-ABC class I(抗人HLA Ⅰ类分子特异抗体，购于北京邦定生物公司)，SP免疫酶标试剂盒购于中山公司，方法按说明进行。FITC标记的羊抗鼠购于北京邦定公司。
1.3 临床观察：隔日观察动物眼睛有无畏光和流泪、毛发有无脱落、消化道有无腹泻以及肢体情况。眼科医师对可疑小鼠进行眼底镜、裂隙灯和解剖镜下检查。
1.4 病理：病变和正常鼠眼球10%甲醛固定，并行软化处理，切片行HE染色。房水涂片行瑞氏染色，显微镜下观察细胞形态和成分，计细胞总数并进行分类计数。
2 结 果
2.1 一般资料
首建鼠10只，F1和F2代仔鼠45只，29只整合有目的基因。全部首建鼠和部分F1和F2代动物行免疫组织化学染色和流式细胞术显示HLA-B2704在外周血、皮肤、消化道有核细胞内高表达，外周血淋巴细胞表面未见表达。
2.2 临床观察
2.2.1 动物发育和眼科症状体征：F1代、F2代和首建鼠共14只患有前葡萄膜炎，毛色为白色13只，黑色1只。二者发病情况有所不同，毛色为白色者患前葡萄膜炎的幼鼠开始睁眼时间较没有发病的小鼠明显晚。未发生疾病者约2周睁眼，而发病者3周后才睁眼。睁眼后即存在明显畏光。2周时全身毛发即较无虹睫炎的小鼠少。畏光程度与脱毛轻重成正比，症状时轻时重。时间最长观察16周，未见自行痊愈。毛色为黑色者患前葡萄膜炎1只，3周时出现脱毛。自下背部开始，逐渐向上，至头部，4周时仅留头部和足部由毛发覆盖。6周时毛发开始恢复，顺序与脱毛时相反，7～8周完全恢复。眼部症状伴随脱毛而出现，并随脱毛恢复而自行消失。可能因为看不到饮食以及动物同时患有腹泻，所以动物体重较正常明显轻。
2.2.2 眼科检查：裂隙灯下可见角膜后沉淀。解剖镜下观察视乳头水肿不明显，视网膜血管无明显扩张。
2.2.3 其他症状：上述发病鼠存在不同程度的腹泻，粪便较正常小鼠稀，色淡，表面有黏液。
2.3 病理
眼睛HE染色：角膜外层上皮细胞增生，柱状上皮排列紊乱。中层胶原纤维排列不整，细胞数目增多。内上皮层细胞肥大，某些部位可见上皮细胞脱落(图1～2)。
房水检查：前葡萄膜炎小鼠房水总细胞数增加，炎性细胞比例较正常小鼠明显增高。细胞分类包括脱落上皮细胞，虹膜色素细胞，淋巴细胞和少量单核细胞等。畏光组3只眼球，房水细胞总数为714，其中，上皮细胞648，炎性细胞66，炎性细胞与总细胞数的比为9.24%。正常对照10只眼球房水细胞总数1 620，其中上皮细胞1 603，炎性细胞12，炎性细胞与细胞总数的比为0.74%。χ2检验显示两组间炎性细胞与总细胞数之比差异存在显著性，P＜0.05。
2.4 糖皮质激素治疗疗效观察
口服地塞米松(剂量为1 mg/kg体重)第4天开始畏光较前减轻，隔日用药持续3周，症状未完全消失。激素治疗停止1周后畏光症状明显加重。
3 讨 论
本实验首次在HLA-B27转基因小鼠观察到前葡萄膜炎，目前在啮齿类转基因小鼠中尚未见到类似报道，为HLA-B27在前葡萄膜炎发病中的作用提供了直接的证据。并且发现其发病特点与人类B27相关性虹膜炎存在许多相似之处，而与已经报道的应用眼部抗原诱导的葡萄膜炎存在明显差别。
目前已经报道的葡萄膜炎模型均由抗原诱导而获得，称为实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis，EAU),所用抗原包括超抗原(S-Ag)和感光器间受体树脂样结合蛋白(interphotoreceptor retinoid binding protein，IRBP)等，实验动物包括兔、豚鼠(guinea pigs)、大鼠和灵长类动物。因为抗原主要来源于感光器细胞层，该细胞层自然成为EAU自身免疫反应攻击的主要对象。其炎症主要位于眼球后部，以后葡萄膜为主，除视网膜、脉络膜肉芽增生外，主要病变为视网膜血管炎和血管周围炎，严重者可发生视网膜剥脱。前房不受累或轻度受累［2］。
HLA-B27与人前葡萄膜炎相关性较强［3］，单纯前葡萄膜炎患者B27阳性率为52%～56%，伴有强直性脊柱炎时阳性率为85%～96%。与B27阴性葡萄膜炎相比，阳性患者发病有其自身的特点［4，5］，如发病较年轻，男性较多，易复发，单侧交替发生，发病重等。说明二者在发病机制上存在一定差别。人类葡萄膜炎以前房为主，主要表现为虹膜睫状体炎，房水中有蛋白渗出，角膜后沉淀物形成(keratic precipitates，KP)，而视网膜较少观察到病变。本实验在HLA-B2704转基因小鼠所观察到的自发性葡萄膜炎以前房为主，病理发现角膜慢性炎症，房水中有淋巴细胞渗出，口服糖皮质激素治疗可以减轻眼部症状，这与人类前葡萄膜炎特点相符。说明就研究人类葡萄膜炎的发病机制、病理表现和治疗而言，这一模型可能较EAU更为适合。
由上述比较可见转基因动物模型产生的葡萄膜炎与EAU在病理上存在一定差别，究其原因可能有以下几种。①H-2的类型不同。Caspi等［6］应用IRBP或S-Ag诱导EAU时发现，不同抗原只能在特定品系的小鼠诱发EAU，即动物对EAU的易感性是由小鼠H-2决定的。进一步实验证明不同的H-2需要不同的抗原表位才能诱发EAU。Willbanks等［7］IRBP诱导EAU时，发现C57BL/6小鼠和转HLA-A2基因小鼠50%发生葡萄膜炎，而HLA-B27阳性小鼠仅20%发病。说明至少在某些品系的小鼠中，HLA-B27的存在并不增加EAU的发病率，同时也提示EAU与B27阳性葡萄膜炎发病机制上可能存在一定差异。在本实验的转基因小鼠中观测到自发性前葡萄膜炎，而其他研究者应用纯系C57小鼠并未见到类似病变，也说明基因背景在发病中的重要性。②EAU与B27阳性人群或转B27基因小鼠发病机制存在差别，或者说诱导EAU的眼部的抗原与引起人类葡萄膜炎的抗原不同。研究表明小鼠和大鼠的EAU是由CD4介导的疾病［6］。而CD4＋T淋巴细胞接受由MHC Ⅱ类分子呈递的抗原。HLA-B27属于MHC Ⅰ类分子，将细胞内抗原呈递给CD8＋T淋巴细胞。虽然对HLA-B27在人类葡萄膜炎中的作用研究较少，但是对B27相关性脊柱关节病的研究可能对其有一定指导意义，而且二者常同时发生。研究已经证实反应性关节炎存在HLA-B27限制的针对微生物抗原的CD8＋细胞毒性T淋巴细胞(microbial antigen-specific cytotoxic T lymphocyteds，CTL)。Khare等［8］实验证实具有B27α1、α2亚基和H-2Kdα3亚基的杂交分子的小鼠，在由无菌环境转至普通环境后可发生与野生型B27相似的关节炎和指甲病变。而这一杂交B27分子至少缺少第三高变区3个假定抗原多肽中的1个，这些实验结果均提示B27可能作为抗原呈递分子而不是由B27降解产物在炎症中发挥作用。目前我们正在观察不同饲养环境中转基因动物葡萄膜炎的发病情况，以进一步阐明其发病机制。
(志谢：衷心感谢北京医科大学人民医院眼科何燕玲医师，病理科虞有智医师的大力支持。)
图1 正常鼠角膜HE×200
2 发病鼠角膜×200
基金项目：国家自然科学基金资助项目 (39470694)
参 考 文 献
1.丁海明，吕厚山，陈占昆，等.转HLA-B2704基因小鼠模型的建立.中华风湿病学杂志，2000，4：11-14.
2.Caspi RR,Roberge FG,Chan CC,et al.A new model of autoimmume disease:experimental autoimmune uveoretinitis induced in mice with two different retinal antigens.J Immunol,1988,140:1490-1495.
3.李凤鸣，主编.眼科全书.中卷.北京：人民卫生出版社，1996.2097-2127.
4.Wakefield D,Montanaro A,McCluskey P.Acute anterior uveitis and HLA-B27.Serv Ophthalmol,1991,36:223-232.
5.Benjamin R,Parham P.HLA-B27 and disease:a consequence of inadvertent antigen presentation?Rheum Dis Clin North Am,1992,18:11-21.
6.Caspi RR,Chan CC,Grubbs BG,et al.Endogenous systemic IFN-gamma has a protective role against ocular autoimmunity in mice.J Immunol,1994,152:890-899.
7.Willbanks GA,Rootman DS,Jay V,et al.Experimental autoimmune uveitis in HLA-B27 transgenic mice.Human Immunol,1997,53:188-194.
8.Khare SD,Lee S,Bull MJ,et al.Peptide binding α1α2 domain of HLA-B27 contributes to the disease pathogenesis in transgenic mice.Human Immunol,1999,60:116-126.
(收稿日期：1999-11-02)
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