NF-κB在狼疮肾炎中的作用

中华风湿病学杂志 2000年第4期第4卷 论著

作者：许韩师　叶任高　张式鸿　李幼姬　杨琼琼　曾丽霞　孙林

单位：许韩师(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)；叶任高(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)；李幼姬(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)；杨琼琼(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)；曾丽霞(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)

关键词：狼疮肾炎；免疫组织化学；NF-κB

　　【摘　要】　目的　了解狼疮肾炎(LN)肾组织中NF-κB表达并探讨其在LN中的作用。方法　以NF-κB亚基p65单抗为抗体，采用微波免疫组织化学法(APAAP法)染色，检测LN肾组织NF-κB表达，并进一步分析其与LN活动指数、肾脏病理和功能损害的关系。结果　狼疮肾炎组织中NF-κB表达较正常肾组织显著增高，尤以WHO Ⅳ型为甚。NF-κB在肾小球和肾小管均有表达，但以肾小管表达更明显。LN肾组织NF-κB阳性细胞数与肾组织活动指数、肾脏病理改变和肾功能损害显著相关。结论　NF-κB可能参与了LN的发病机制，检测其在肾组织中的表达可作为反映狼疮肾组织活动病变和进行性肾损害的参考指标。

Expression of transcription of NF-κB in renal tissue of lupus nephritis

XU Hanshi,YE Rengao,ZHANG Shihong,et al.

　　Kidney Institute,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China

　　【Abstract】　Objective　To investigate the role of NF-κB in the pathogenesis of lupus nephritis (LN).Method　A microwave-based immunohistochemistry (APAAP) was used to detect the expression of NF-κB p65 in renal tissue of LN and normal control.At the same time,the correlation between expression of NF-κB and renal injuries in LN was examined.Results　The expression of NF-κB in LN was higher than that of normal control,especially in WHO IV LN.The number of positive cell expressed NF-κB in renal tissue of LN showed a strong correlation with kidney activity of LN histological and functional changes.Conclusion　NF-κB may play an important role in the pathogenesis of LN,and the number of positive cell expressed NF-κB may be considered as a predictor for LN,activity and progressive renal injury.

　　【Key words】　Lupus nephritis;　Immunohistochemistry;　NF-kappa B

　　NF-κB(nuclear factor of kappa B)是由p65和p50蛋白亚基组成的二聚体。作为具有多向性调节作用的核转录因子，NF-κB广泛参与许多基因，特别是免疫炎症相关基因的转录调控。NF-κB的主要生物功能之一就是通过调控一系列重要的免疫因子基因表达参与免疫和炎症反应，同时也参与某些细胞的生长调控^［1］。近期实验研究表明，NF-κB可调控体内外肾小球系膜细胞的增生及其分泌的多种细胞炎症因子^［2，3］。但有关NF-κB在人类肾小球炎的表达及其作用尚未见文献报道。本文在国内外首次报道NF-κB在人类狼疮肾炎肾组织中的表达情况及其与肾脏病理改变、肾功能损害之间的关系，旨在探讨NF-κB在狼疮肾炎中的作用。

　　1　资料与方法

　　1.1　病例选择：16例狼疮肾炎患者均为女性，年龄15～40岁，平均(28±7)岁，诊断符合1982年美国风湿病学会制订的系统性红斑狼疮(SLE)诊断标准及肾活检组织病理检查确诊。根据肾活检按WHO病理分型分为：Ⅱ型2例，Ⅲ型2例，Ⅳ型9例，Ⅴ型3例。对照组5例，均来自因肾肿瘤行肾切除但远离肿瘤部分的正常肾组织，3例非LN系膜增生性肾炎均为女性，平均年龄(32±82)岁。

　　1.2　肾组织NF-κB检测：采用微波免疫组织化学染色，即APAAP法。NF-κB p65单抗购自BM公司，APAAP(碱性磷酸酶-小鼠抗碱性磷酸酶免疫复合物)整套试剂盒购自DAKO公司。具体步骤为：取3 μm厚的10%甲醛固定的石蜡切片常规脱蜡水化；浸入3% H₂O₂ 5 min(去除内源性过氧化氢酶活性)；置0.1 mol/L pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中行微波修复抗原(低中档火10 min)；正常山羊血清封闭；甩去多余液体，加适量稀释的I抗(NF-κB p65单抗)，室温1h；TBS漂洗后，加适量Ⅱ抗(兔抗鼠IgG)，室温下30 min；TBS漂洗后，加足量APAAP，室温下30 min；TBS漂洗，加足量已过滤的底物溶液，室温20 min；TBS漂洗，1%苏木精轻染；水洗，自然晾干，水性封片剂封片。计算平均每个肾小球横切面中NF-κB p65 阳性细胞数；计算100个肾小管中NF-κB p65阳性小管数，结果以百分数表示。

　　1.3　肾组织常规光镜检查：①计算肾小球横切面(gcs)细胞数目并作半定量定级^［4］：0级(正常，＜60个细胞/gcs)，Ⅰ级(轻度增多，60～89个细胞/gcs)，Ⅱ级(中度增多，90～120个细胞/gcs)，Ⅲ级(重度增多，＞120个细胞/gcs)；②狼疮肾炎肾组织活动指数计算：活动指标包括重度细胞增多、细胞性新月体、微血栓形成、毛细血管壁破坏、白金耳、苏木素小体、间质细胞浸润，小动脉纤维坏死、小管坏死。以上各项按轻、中、重分别评为1、2、3分相加得总分；③计算肾皮质出现病理损害的肾小管百分率。

　　1.4　实验室检查：病人于肾活检前一天收集血、尿标本，测定24 h尿蛋白定量、尿N-乙酰β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)和血清肌酐(SCr)。

　　1.5　统计学处理：定量或半定量处理后结果以中位数(最小数～最大数)表示，组间比较用秩和检验；相关关系分析采用线性回归或Spearman等级相关分析。

　　2　结　　　果

　　2.1　NF-κB 在肾组织中的表达：对照组肾组织，仅见极少部分的肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞表达较弱的NF-κB。狼疮肾炎病人肾组织，NF-κB在肾小球及肾小管均呈高水平的表达，尤其以WHO Ⅳ型LN更为明显，见表1及图1～3。3例非LN系膜增生性肾炎肾组织亦有一定量的NF-κB表达，见图4。

　　2.2　LN肾组织NF-κB表达与肾组织病理学指标相关分析：LN病人肾组织NF-κB表达与肾小球细胞数增多、狼疮肾组织活动指数及肾小管间质损害程度呈正相关关系，见表2。

　　2.3　LN肾组织NF-κB表达与肾功能指标的相关分析：LN病人肾组织NF-κB表达与24 h尿蛋白定量、NAG活性成正相关，而与肌酐清除率(Ccr)成负相关关系，见表2。

　　3　讨　　　论

　　NF-κB是一种介导细胞内信号传递的重要转录因子，与其他大多数的转录因子不同，一般情况下NF-κB与抑制分子IκB(Inhibitory κB)结合以非活化形成存在于细胞质中。当NF-κB被肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1(IL-1)、过氧化氢、放射性离子和病毒感染等刺激活化后，IκB发生磷酸化和泛素化，继而降解而与NF-κB解离，由p50和p65两个亚基组成的NF-κB二聚体从细胞质快速转移至细胞核中，参与基因的转录调控^［5］。NF-κB的反应成分中含有许多免疫炎症相关基因，包括TNF、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、黏附分子(ICAM-1，VCAM-1)、MHC Ⅱ类抗原、MCP-1等^［1］，这些基因及其蛋白产物在许多肾小球肾炎中的表达明显增高，提示NF-κB可能在肾小球肾炎的发病机制中起重要作用。目前，有关NF-κB与狼疮肾炎的关系国内外尚未见文献报道，为此，我们采用微波免疫组织化学染色方法观察NF-κB在狼疮肾炎肾组织中的表达并探讨其与肾损害的关系。

表1　LN肾组织NF-κB p65表达情况(M)

　　注：与对照组比较^*P＜0.01；与非Ⅳ型LN比较^ΔP＜0.05

表2　16例LN患者肾组织NF-κB表达与肾组织病理学和肾功能指标的相关系数(r)

　　注：对应两组比较^*P均＜0.05，^**P均＜0.001　　本文实验结果显示，正常人肾组织中可出现少部分的肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞表达较弱的NF-κB，提示适量的NF-κB活化可能是调节正常肾脏细胞生理功能所必须的。

　　与正常肾组织比较，狼疮肾炎患者肾组织中肾小球NF-κB阳性细胞数及NF-κB阳性小管百分率均显著增高，其中尤以病变最严重的Ⅳ型LN更为明显。LN最常见的病理类型是弥漫增生型(即WHO Ⅳ型)，而系膜细胞及其基质的增生在其发生、发展中扮演着重要的角色。体外细胞培养实验证实，NF-κB的活化与肾小球系膜细胞增生密切相关，且对系膜细胞分泌的多种化学因子如TNF、IL-6、VCAM等起着中心调节作用^［2］。Kashihara等^［3］将NF-κB反义寡核苷酸经左肾动脉导入抗Thy-1抗体肾炎模型鼠中，发现可减少系膜细胞增生和PDGF、IL-6和TNF-α等细胞因子的表达。本文发现LN肾组织NF-κB表达与肾小球细胞数呈显著正相关，提示NF-κB与肾小球细胞增生密切相关。因此，上述研究提示，NF-κB在肾小球疾病的病理损害中有着重要作用，其可能是通过调控与肾小球炎症密切相关的免疫炎症因子基因表达而发挥作用的，但具体的生化机制有待进一步研究。

　　本文结果还显示，LN病人肾组织肾小球NF-κB阳性细胞数与肾小球细胞数增多，24 h尿蛋白定量和狼疮肾组织活动指数呈显著正相关关系，提示LN肾组织NF-κB的表达量可反映LN肾组织病理损害程度。因为肾组织活动指数升高常提示LN处于活动期，所以LN肾组织中NF-κB的过度表达可视为狼疮活动的参考指标之一。

　　近年研究认为，肾小管间质病变的严重程度与肾功能恶化速度及其远期预后的关系比肾小球损害更加密切。LN病人常伴有严重的小管间质损害，往往是影响其肾脏病理进程和肾功能的重要因素。目前认为，肾组织中单核细胞的局部浸润在小管间质病变中起非常重要的作用，而其中必须有趋化因子的参与。研究表明，在实验性免疫复合物性肾炎，NF-κB可通过介导单核细胞趋化因子(MXP-1)合成参与肾组织中单核细胞的募集(指单核细胞趋化、聚集地肾脏局部)反应^［6］。本文结果亦显示，肾小管间质NF-κB的表达量与肾小管间质损害、尿NAG排泄量和肌酐清除率密切相关，提示NF-κB参与了LN的肾小管间质病理损害过程，其表达量的多少可作为预测肾功能损害进展的指标之一。

图1　NF-kB在正常人肾组织中的表达（红色信号代表 NF-kB ，以下雷同)(APAAP 10×10

2 NF-kB在 WHO II型狼疮肾炎病人肾

　　组织中的表达(APAAP)10×10

3 NF-kB在WHO IV型狼疮肾炎病人肾组织的表达(APAAP) 10×10

4 NF-kB在系膜增生性肾炎

　　病人（非 LN）肾组织中的表达(APAAP) 10×10

　　基金项目：中山医科大学211工程重点资助项目 (98150)

　　作者单位：孙林(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)

　　张式鸿(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所检验科)

参 考 文 献

　　1.Balclwin AS Jr.The NF-κB and IκB proteins:new discoveries and insights.Ann Rev Immunol,1996,14:649-681.

　　2.Guijarro C,Kim Y,Kasiske BL,et al.Central role of the trascription factor NF-κB in mesangial cell production of chemokines.Contrib Nephrol,1997,120:210-218.

　　3.Kashihara N,Maeshima Y,Sekikawa T,et al.Inhibition of human mesangial cell proliferation by decoy oligonucleotiole targeting the transcription factor,NF-κB.J Am Soc Nephrol,1995,6:843.

　　4.Conraol LP.Evaluation of kidney biopsy specimens.In:Tisher CC,Barry M,eds.Renal pathology with clinical and functional correlations.Philadelphia:J B Lippincott Company,1994.85-115.

　　5.Baeuerle P,Henkel T.Function and activation of NF-κB in the immune system.Ann Rev Immunol,1994,12:141-179.

　　6.Ruiz OM,Bustos M,Miguel AH,et al.Angiotensin Ⅱ participates in mononuclear cell recruitment in experimental immune complex nephritis through nuclear factor NF-κB activation and monocyte chemoattractant protein-1 synthesis.J Immunol,1998,161:430-439.

(收稿日期：1999-10-12)