小剂量阿斯匹林在显微血管外科应用中的研究

　　中国修复重建外科杂志2000年第14卷第3期

安智全　顾玉东　钟高仁　朱建华　徐明光　许小风　高福琴

　　摘　要　目的　研究小剂量阿斯匹林对小动脉吻合口血小板沉积及对凝血系统功能的影响，为临床用药提供实验依据。方法　SD大鼠28只，实验组(21只)阿斯匹林4 mg/kg，经股静脉插管注射，对照组(7只)用等体积生理盐水。实验组动物按给药后存活24、48和72小时再分组，每组7只。给药后，在上述时间间隔，经心脏穿刺采血，测血小板最大聚集率(MAR)、凝血酶原时间(PT)和白陶土部分凝血活酶时间(KPTT)。新西兰白兔16只，分实验组和对照组各8只，实验组耳缘静脉注射阿斯匹林(4 mg/kg)，对照组用等体积生理盐水。48小时后，股动脉腹股沟韧带至腹壁浅动脉段切断，端端吻合。恢复血流后15和120分钟，分别切取通畅的左、右侧吻合口段股动脉，用¹²⁵Ⅰ-SZ-21(抗GPⅡa/Ⅲa单克隆抗体)放射免疫结合分析法处理，测吻合口放射活性。结果　阿斯匹林静脉注射后24和48小时，KPTT较对照组平均分别延长42.56%和35.33%，其中，用药后24小时组差异非常显著(P＜0.001)。用药后72小时内，实验组PT值均较对照组延长，但差异无显著意义(P＞0.05)。用药后72小时内，MAR均明显低于对照组，差异非常显著(P＜0.001)。术后15分钟，实验组吻合口抗血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅱa抗体的放射活性明显高于对照组，平均增加110%，差异非常显著(P＜0.001)。结论　小剂量阿斯匹林静脉用药，可明显抑制内源性凝血系统的功能，抑制血小板聚集，但对外源性凝血系统的功能无影响。能使术后早期的动脉吻合口血小板沉积明显增加，但这种增加不足以引起吻合口血栓形成。小剂量阿斯匹林对全身和对吻合口局部的作用不一致。

　　关键词：阿斯匹林　小剂量　股动脉　端端吻合

　　阿斯匹林是一种抗血小板药物，在游离组织移植或断肢再植中广泛应用。其作用机制在于使血小板环氧化酶乙酰化，血栓烷A₂(thromboxane a₂,TXA₂)生成减少，抑制血小板聚集，防止血栓生成^［1］。大剂量的阿斯匹林可同时抑制血管内皮细胞的环氧化酶，使扩血管的前列腺素I₂(prostaglantin i₂,PGI₂)生成减少，血小板聚集增加，血栓生成。Wieslander等^［2～6］用多种动脉血栓生成动物模型研究了小剂量阿斯匹林的作用，结果不尽一致，特别是对吻合口血小板沉积的影响研究更少见。为此，我们通过动物实验，对这一问题进行探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1　阿斯匹林对凝血系统功能的影响

　　健康SD大鼠28只，体重320～370 g，1%戊巴比妥钠腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，股静脉插管，实验组(21只)阿斯匹林赖氨酸盐(安徽蚌埠医药研究所实验厂提供，每克含乙酰水杨酸0.5 g)按7.2 mg/kg(相当于阿斯匹林4 mg/kg，临用前用生理盐水配制，浓度1.8 mg/ml)股静脉注射，对照组(7只)用等体积生理盐水。实验组动物按给药后24、48和72小时再分成三组，每组7只，给药后经心脏穿刺采血3 ml，枸橼酸钠抗凝(v/v,6∶1)，以腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)(Sigma公司提供，工作浓度5 μmol/L，用0.01 mol/L PBS pH7.4配制)为激活剂、TYXN-智能血液凝集仪(上海通用机电技术研究所生产)测血小板最大聚集率(maximal aggregation rate of platelet,MAR)，用ACL3000-自动凝血分析仪(美国库尔特公司生产)及配套试剂盒测凝血活酶时间(prothrombin time,PT)和白陶土部分凝血活酶时间(kaolin partial thromboplastin time,KPTT)。

　　1.2　阿斯匹林对吻合口血小板沉积的影响

　　1.2.1　抗血小板抗体的标记　单克隆抗体SZ-21(抗GPⅡb/Ⅲa抗体，由苏州医学院血栓研究室提供)用氯胺-T法同位素¹²⁵Ⅰ标记(Na¹²⁵Ⅰ液由中国原子能研究院提供)。

　　1.2.2　标本制备及测定　新西兰白兔16只，体重2.2～2.5 kg，分实验组和对照组，各8只，实验组经耳缘静脉注射阿斯匹林赖氨酸盐(7.2 mg/kg)，对照组用等体积生理盐水。48小时后，耳缘静脉注射1%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，仰卧位固定，暴露股动脉腹股沟韧带至下腹壁浅动脉分支段，切断后端端吻合，共10针。恢复动脉血流后15和120分钟，勒血实验证实吻合口通畅后，分别阻断左、右吻合口近端血流，取包括吻合口在内共约6 mm长股动脉段，4%多聚甲醛固定，内膜面朝上展开并固定于透明胶带上，用抗GPⅡb/Ⅲa抗体的放射免疫结合分析法处理。方法：标本用PBS(0.01 mol/L pH7.4，下同)洗三遍，每次10分钟，入0.3%牛血清白蛋白(用PBS配制)，37℃孵育30分钟，加入¹²⁵Ⅰ-SZ-21单抗溶液300μl(2.6×10⁴cpm)，4℃孵育72小时，PBS洗，FJ-2008放射免疫计数仪测放射活性。以正常血管组织作为本底。

　　1.3　统计学处理

　　所有实验数据均采用t检验法处理。

　　2　结果

　　2.1　阿斯匹林对PT和KPTT值的影响

　　阿斯匹林静脉注射后对大鼠PT和KPTT的影响见表1。给药后24和48小时，KPTT较对照组分别延长42.56%和35.33%，给药后72小时，两组基本相同，其中，给药后24小时两者有非常显著性差异(P＜0.001)。用药后72小时内，实验组PT值均较对照组延长，但各组差异均无显著性意义(P＞0.05)。

　　2.2　小剂量阿斯匹林对血小板聚集功能的影响

　　浓度5 μmol/L的ADP引起正常大鼠血小板50%的最大聚集率的溶液体积为15μl。阿斯匹林静脉注射后24、48和72小时对大鼠MAR的影响见表1。给药后各时间组，MAR分别减低49.60%、41.10%和32.55%，差异均非常显著(P＜0.001)。

表1　小剂量阿斯匹林对大鼠PT、KPTT和血小板MAR值的影响(X±s)

Tab.1　The effects of low dose aspirin on the pT、KPTT and platelet MAR platelet in the rat (X±s)

　　2.3　小剂量阿斯匹林对小动脉吻合口血小板沉积的影响　　用氯胺-T法标记SZ-21的标记率大于85%，放射性得率大于65%，放射化学纯度经纸层层析法、醋酸纤维薄膜电泳和高效液相色谱法测定均大于95%。纸层分析法标记抗体R_f0.8-1.0，游离碘R_f0.8-1.0。术后15和120分钟吻合口均通畅。

　　阿斯匹林注射后48小时，对术后15和120分钟吻合口血小板沉积的作用见表2。术后15分钟，实验组吻合口¹²⁵I标记抗血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅱa抗体(SZ-21)的放射活性较对照组增加109.78%，有非常显著性差异(P＜0.001)。术后120分钟实验组吻合口放射活性稍高于对照组(4.06%)，无显著性差异(P＞0.05)。

表2　小剂量阿斯匹林对家兔股动脉吻合口血小板沉积的影响(n=8,X±s)

Tab.2　The effects of low dose aspirin on the deposition of the platelets at the anastomotic sites in the rabbit femoral arteries(n=8,X±s)

　　3　讨论3.1　小剂量阿斯匹林对凝血系统功能的影响

　　阿斯匹林作用的机制是抑制PGs合成的限速酶——环氧酶的活性，降低TXA₂的生成，抑制血小板聚积^［7］。

　　May等^［8］对健康志愿者的研究发现，小剂量阿斯匹林可抑制胶原、瑞斯托霉素、花生四烯酸以及胶原、链激酶、ADP、肾上腺素和血小板激活因子(platelet activating factor,PAF)的各种联合所引起的血小板聚集，用药2天后的作用相同，但也发现ADP诱导血小板聚集的作用不明显。Feng等^［9］证明小剂量阿斯匹林不仅可抑制胶原和肾上腺素诱导的血小板聚集，也可抑制ADP诱导的血小板聚集，ADP在常规的30μmol/L浓度时，不出现双相的血小板聚集。May等的ADP浓度为10μmol/L。我们的结果证实，常规的1.0 μmol/L浓度ADP不能诱导血小板出现50%的聚集率，而5μmol/L ADP浓度则能达到50%的血小板聚集率的ADP量为15 μl。我们的研究发现小剂量阿斯匹林静脉注射72小时内均能显著抑制ADP诱导的血小板聚集。

　　我们的研究结果同时也表明，阿斯匹林静脉用药后24小时，KPTT值较对照组明显延长，而用药后72小时内PT值和对照组相比未见显著改变，表明小剂量阿斯匹林静脉用药，对内源性凝血系统有更明显的抑制作用。

　　3.2　小剂量阿斯匹林对小动脉吻合口血小板沉积的影响

　　血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa是一种纤维蛋白原受体，参与血小板的激活过程，正常人每个血小板表面GPⅡb/Ⅲa分子数为(5.45±1.19)×10⁴，我们以¹²⁵Ⅰ标记抗GPⅡb/Ⅱa抗体SZ-21与吻合口沉积血小板特异性结合的放射免疫结合方法，证明小剂量阿斯匹林静脉注射后48小时，可使家兔股动脉端端吻合术后15分钟的吻合口SZ-21放射活性较对照组增加110%，差异非常显著，术后120分钟，实验组和对照组无明显区别。Salemark等^［3］将体外标记血小板静脉注射后，在家兔耳中央动脉端端吻合和动脉内膜切除模型中证实，术中小剂量阿斯匹林动脉灌注不能降低标记血小板在吻合口的沉积，但术前10小时用药可降低吻合口血小板放射活性。Basile等^［5］用家兔股动脉外膜内翻移植模型发现，小剂量阿斯匹林经灌胃给药，术前3天和术后7天连续用药，不能增加吻合口通畅率。Peter等^［6］认为，小剂量阿斯匹林术中动脉灌注可提高大鼠股动脉外膜内翻吻合的血管通畅率。我们的研究中阿斯匹林经静脉术前48小时给药，吻合口血小板沉积明显增加。表明小剂量阿斯匹林术前经静脉给药，可增加吻合口血小板沉积，但这种作用的强度有限，不足以引起吻合口血栓形成。阿斯匹林的这种作用的机制不清。阿斯匹林的半衰期较短，用药时间和损伤血管时间间隔过长，可使其体内药物浓度降低^［1］。有报道认为，超低剂量阿斯匹林可导致血管内血栓形成^{［10、11］}。因超低剂量阿斯匹林只抑制血管PGI₂生成，而不抑制血小板环氧酶，使TXA₂的生成增加，血栓易形成^［12］。我们研究的结果是否与这种机制有关，需进一步研究。

　　我们的研究结果表明，小剂量阿斯匹林可抑制内源性凝血系统的功能，抑制血小板聚集，这是小剂量阿斯匹林在显微外科应用的基础。同时也发现，小剂量阿斯匹林能使术后早期的动脉吻合口血小板沉积增加，但这种增加是有限的，不足以引起吻合口栓塞。小剂量阿斯匹林对全身和对吻合口局部的作用不一致。

　　基金项目：上海市领先学科(95-Ⅲ-1)和国家自然科学基金资助项目(392303401)

　　作者单位：安智全(上海市第六人民医院骨科　上海，200233)

　　顾玉东(上海医科大学附属华山医院手外科)

　　钟高仁(上海医科大学药学院放射药学教研室)

　　朱建华(上海医科大学药学院放射药学教研室)

　　徐明光(上海医科大学附属华山医院检验科)

　　许小风(上海医科大学附属华山医院检验科)

　　高福琴(上海医科大学附属华山医院检验科)

　　参考文献

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