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睾丸生殖细胞凋亡及其调控研究进展
国外医学计划生育分册1999年8月第18卷第3期
河北医科大学第二医院（050000）
王亚轩综述 蔡广增 王振海审校
摘要在睾丸的正常生精过程中存在生殖细胞的凋亡现象，这是清除过量或受损生殖细胞的一种重要方式，而且与男性生育密切相关。生殖细胞凋亡受到多种因素的调控，其中基因调控起着关键的作用。Bcl-2家族、p53、Fas和C-myc等多种基因共同作用决定了生殖细胞的生存与死亡，对于维持精子的正常数量和质量具有重要意义。
关键词 生殖细胞 细胞凋亡 基因
细胞程序性死亡（programmed cell death）现统称为细胞凋亡（apotosis）。细胞凋亡是在生物进化中保留下来的细胞死亡过程，对多细胞机体的正常发育和保持稳定起重要作用。这一过程受基因和其它多种因素调控，是生物生长发育过程中普遍存在的生理现象。在生理状态下，细胞凋亡参与体内正常细胞的更新和异常细胞的清除，对维持个体正常生理过程和功能表达具有重要生物学意义。这一过程的紊乱与多种疾病的发生密切相关。在哺乳动物，包括人的睾丸生精过程中也存在生殖细胞的凋亡现象，现综述如下。
一、生精细胞凋亡
早在本世纪初，就有人发现在睾丸生精过程中存在着生殖细胞的变性退化，所产生的精子数目比精子生成总量的理论值要减少25%-75%。后经研究证实，这种退化即为细胞凋亡。细胞凋亡与坏死有明显区别：坏死亦可称细胞中胀死亡，是指细胞在损伤等病理状态下，质膜通透性增加，胞体肿胀，线粒体、内质网及其他细胞器膨大，最终导致胞核弥散性降解，胞膜破裂，胞内物质溢出致细胞间隙而引起周围组织细胞发生炎症反应。在坏死过程中，由于溶酶体酶的释放，脱氧核糖核酸（DNA）随机率解为长短不等的片段，这种被动死亡不消耗能量。细胞凋亡则是组织对各种刺激的主要反应过程，表现为细胞收缩、体积变小、细胞间连接减少，染色体广泛收缩，但细胞器仍保持完整，最终细胞分裂成一个或多个有完整包膜的凋亡小体，被周围的巨噬细胞所吞噬，不引起炎症反应。在此过程中，由于内源性核酸内切酶活性增强，在核小体之间特异地剪切DNA，形成大小约180-200 bp倍数的DNA片段，从而形成了细胞凋亡的特征性改变。近来研究还发现，在生精细胞凋亡的发生过程中，细胞的氧化代谢作用仍十分活跃，三磷酸腺苷（ATP）保持在正常水平，是一个需要能量的过程。
目前，检测生精细胞凋亡的方法颇多。最初采用苏木精和伊红染色（HE）在光学显微镜下可观察到凋亡细胞的形态学改变，在电子显微镜下可观察到凋亡细胞染色体浓缩、细胞膜泡状突起及凋亡小体的形成等特征性改变。琼脂糖凝胶电泳测DNA，可显示特异性的梯子状带纹（ladder条纹）明显地区别于坏死细胞的不规则DNA降解，这种DNA梯带是凋亡的早期特征，先于核固缩及凋亡小体的出现。流式细胞学技术可观察DNA断裂所致的亚二倍体核型峰的出现，并可定量检测凋亡生精细胞所占的比例。原位3´羟基末端DNA标记法（in situ 3´ end DNA-labling,ISEL）是一种新的特异性强的检测生精细胞凋亡的方法，不仅能原位显示有HE改变的凋亡细胞，而且能显示形态学改变不明显的早期凋亡细胞，并可进行良数。
在人类睾丸的正常生精过程中存在着生殖细胞的凋亡，这对于清除受损生精细胞、控制其数量具有重间意义，Sinha hikim[1]对正常人睾丸研究发现，在精原、精母和精子细胞中均有凋亡现象，其中以精子细胞为主，其次为表母细胞，精原细胞凋亡为少，且存在有种族差异。另外有人发现，男性不育患者睾丸生殖细胞的凋亡是增加的。Lin[2]对51例无精子症和严重少精子症患者进行了睾丸活检，采用HE染色观察凋亡小体的数目，结果发现病理表现为生精功能低下和生精阻滞的患者，睾丸生殖细胞凋亡明显高于有正常生精功能和支持细胞综合征的不育患者。对男性射精中精子的凋亡进行观察发现，正常生育和各种原因所致的不育男性中精子凋亡数目很少占精子总数的0.1%，而不育患者则明显升高，其中精索静脉曲线患者为10%，隐睾患者为20%，精子成熟障碍者为25%，这表明睾丸生殖细胞凋亡发生紊乱可能是引起男性不育的重要原因。
二、生精细胞凋亡的影响因素
（一）内分泌因素 众多研究证实，促性腺激素、雄激素以及多种生长因子在生殖细胞的分裂、增殖、分化、成熟等过程中起重要作用。这些激素分泌异常时，可引起生精细胞出现病理改变。给与大鼠促性腺激素释放激素（GnRH）的拮抗剂以降低其体内促卵泡成熟激素（FSH）与黄体生成素（LH）水平，会导致大鼠睾丸内凋亡的DNA片段大量增加。切除大鼠的脑垂体同样也可引起精原细胞、细线前期和粗线斯精母细胞及精子细胞大量凋亡，但生殖细胞的分化并未完全停止，对去垂体大鼠补充FSH和人绒毛膜促性腺激素（hCG）则能明显抑制DNA的降解和生精细胞的凋亡[3]。给大鼠注射一种能够选择性杀死睾丸间质细胞的毒性药物，以抑制其睾丸内睾酮的含量，结果发现，几乎所有阶段的生精细胞都发生凋亡。Fan4]也发现，将雄性小鼠性腺切除后，可导致附睾的头、体、尾均发生细胞凋亡，给与雄激素替代治疗后可使凋亡的细胞发生逆转。这表明促性腺激素尤其是FSH和雄激素是睾丸生殖细胞生存所必需的。
（二）特殊的生精上皮时相 采用ISEL法显示，在成熟大鼠的生精过程中，第Ⅰ、ⅪⅤ阶段均出现自发细胞凋亡，Billing[3]在对成年大鼠的睾丸研究中发现，生殖细胞凋亡的DNA片段在曲细精管第Ⅷ期最少，第Ⅰ、Ⅷ和 Ⅻ期最多，另有研究表明，凋亡的DNA片段主要存在于正常大鼠曲细精管的第Ⅰ、Ⅸ-Ⅺ、Ⅻ-ⅪⅤ期，当应用GnRhH拮抗剂后，在第Ⅶ-Ⅷ期生精细胞凋亡增加两部以上，在Ⅰ、Ⅱ-Ⅳ、Ⅴ-Ⅵ、Ⅸ-Ⅺ、Ⅻ-ⅪⅤ也有明显增加[5]。Yin[6]以成年鼠为研究对象建立隐睾模型，结果发现，除第Ⅵ和第Ⅷ期外，其它所有阶段的生精细胞凋亡均明显增加。同时还发现，初级精母细胞最易发生凋亡，而精原细胞和精子细胞的凋亡水平则比较低。生殖细胞凋亡明显受曲细精管上皮周期的特异阶段的影响，这可能与生殖细胞发育的特定阶段需要适当的激素刺激及营养供应密切相关[7]。
（三）动物所处的发育阶段 许多动物在开始发育形成曲细精管上皮的过程中都会出现大量的生殖细胞凋亡。对小鼠在胚胎第13 d至生后7周不同发育阶段的睾丸进行了观察，发现在胚胎第13 d和生后第10-13 d生殖细胞发生两次大规模凋亡[7]。Rodriguez[8]采用原位标记显示，在正常小鼠出生后2周睾丸出现生殖细胞凋亡，第3周达高峰，第4周凋亡逐渐减少，以后在成年期一直维持较低水平。同样对在鼠睾丸进行了DNA检测，也发现凋亡的DNA片段在生后6-28日龄的大鼠睾丸内最多，以后随年龄的增加又逐渐减少。Furuchi[9]研究认为动物发育早期出现的生精细胞，另一方面也可能是生精细胞分化所必需。对青年和老年两组人群的研究显示，睾丸A型和B型精原细胞数在两个年龄组无明显差异，但根据晚期精母细胞数和早期精子细胞数推测得到的精子生成量，老年组均低于青年组，这似乎说明老年人生精细胞凋亡增加。
（四）各种理化因素 温度的变化对生精细胞有明显影响，将睾丸在43℃放置30min，会使精原细胞及细线斯初级精母细胞发生凋亡。动物模型证实，隐睾时睾丸生精能力丧失与睾丸周围的温度较高导致的生精细胞凋亡增加有关[10]。低温同样也可引起生精细胞的凋亡增加，将大鼠丸在10℃放置30min，曲细精管第Ⅻ-ⅪⅤ期的凋亡明显增加，其中主要精母细胞和A2型精原细胞[11]。接触某些化疗药物或化学毒物也可影响生殖细胞凋亡。大鼠接触70 mg/kg的环磷酰胺，4 h后生精细胞凋亡明显增加，12 h达高峰，24 h迅速下降。给与大鼠静脉注射25 mg/kg的二硝基苯后24-48 h也出现明显增加的凋亡[12]。输精管的机械性梗阻和放射线照射均可引起细胞凋亡的增加，其意义可能在于清除受损的生精细胞以减少有害因素的影响。
三、生精细胞凋亡的基因调控
睾丸生殖细胞的凋亡同细胞的增殖分化一样受多种基因控制。凋亡相关基因分为凋亡刺激性基因和凋亡抑制性基因，它们所表达的基因产生具有协同或拮抗作用，维持着一种动态平衡，共同控制着生精细胞的凋亡。
（一）Bcl-2基因 是与细胞凋亡关系密切的基因家族之一。该家族主要包括Bcl-2、Bcl-X、Bac、Bak和Mcl-1。其中Bcl-2在抵抗细胞凋亡及延长细胞寿命方面的作用最具代表性。Bcl-X编码两种长度不同的蛋白质，长的形式（Bcl-XL）与Bcl-2、Mcl-1一样具有抑制细胞凋亡的作用；而短的形式（Bcl-XS）则与Bac、Bak作用相似，过量表达可加速细胞凋亡的进程。有人对鸡睾丸的发育加速细胞凋亡的进程。有人对鸡睾丸的发育过程研究发现，在鸡胚胎期的睾丸中几乎检测不到，而Bca-XL在未成熟和成熟的睾丸中均有表达。由于成熟睾丸中处于减数分裂期及减数分裂后的细胞占大多数，因此说明Bcl-2和Bcl-XL在鸡精原细胞减数分裂及减数分裂后细胞凋亡过程的调节作用有所不同[15]。Rodriguez[8]研究发现，在正常小鼠出生后2-4周睾丸出现大量的生殖细胞凋亡，同时伴有暂时性的Bax高表达，但随小鼠的发育成熟细胞凋亡明显减少，Bax也很难再检出。而Bax基因缺陷的小鼠睾丸生精细胞却不能进一步分化成熟。在Bcl-2转基因小鼠睾丸中，由于Bcl-2的过度表达，发育早期的生殖细胞大规模凋亡被抑制，生殖细胞大都停留在精原细胞和双线期精母细胞以前的阶段，精子生成明显减少而致不育[9]。以上结果表明，生精细胞凋亡与Bcl-2基因家族有着密切的关系。
（二）p53基因 正常p53基因即野生型p53具有促进细胞凋亡作用，而突变型p53基因则具有抑制细胞凋亡的作用。p53基因的表达产生通过参与细胞DNA转录而起作用，具有抗细胞增殖的功能。当细胞DNA损伤时，p53转译水平升高，使DNA复制受抑，导致受损伤细胞生长停滞于G0/G1期而不进入S期，为细胞赢得修复DNA损伤的时间，不能得到及时修复的损伤细胞则在p53中介下进入细胞凋亡途径。已经证实，p53在调节睾丸生殖细胞的分裂增殖和凋亡方面起着重要的作用。有人报道，在正常大鼠的睾丸内即有p53表达，且主要集中在减数分裂前细线期到粗线期的精母细胞，可能参与了同源染色体配对过程，与精母细胞的减数分裂有密切关系。当大鼠睾丸受到γ射线照射，p53表达明显增加并呈剂量依赖性，同时伴有以精母细胞为主的细胞凋亡增加[14]。Stephen[16]采用免疫组织化学和原位杂交技术发现，大鼠睾丸内除成熟精子外的各级生殖细胞核内均存在p53的表达，并且与脱氧核糖酸酶Ⅰ（DNasⅠ）基因的表达相一致，而且证实DNaseⅠ与核酸内切酶一样具有导致DNA降解引起细胞凋亡的功能，因此p53表达与生殖细胞凋亡的启动有关。
（三）Fas基因 其编码的Fas蛋白是一种细胞跨膜蛋白。在其分子结构中，膜外区的氨基酸序列具有膜受体的特点，可以与其配基Fasl特异结合；其膜内区有段一由70个氨基酸组成的肽链，在细胞凋亡过程中发挥着细胞凋亡的传导作用，故将其称之为“死亡基因”。Fasl是一种膜型细胞因子，当与Fas相互结合，可导致表达Fas蛋白的细胞迅速发生凋亡。Northrn印这次显示，在正常睾丸组织中即存在Fas及Fas配基信使糖核酸（mRNA）的表达。给与大鼠具有支持细胞（serli'3 cell）毒性的药物（MEHP和2,5-HD）后大鼠的生精细胞凋亡明显增加，以精母细胞为主。免疫组织化学分析显示，在曲细精管Fas及Fasl表达是增加的，其中Fas主要见于精母细胞，而Fasl仅局限于支持细胞与生精细胞相连接区域的胞浆内。聚合酶链反应（PCR）显示，Fas和Fasl mRNA表达水平与生精细胞的凋亡率呈正相关。同时对支持细胞和生殖细胞的体外培养还发现，加入Fas抗体可导致生殖精细胞凋亡增加，而用药物阻断支持细胞的Fasl表达则增加生精细胞的生存，说明在大鼠生精过程中，支持细胞对生殖细胞的凋亡控制与Fas-Fasl介导有关[17]。Suzuki[18]以切除性腺的雄性小鼠作为体凋亡模型，结果发现，小鼠的生殖管道（附睾和前列腺）首先发生Bcl-2水平的下调，然后出现Fas的迅速表达，最后发生凋亡的DNA片段增加。对Fas基因缺陷的lpr小鼠进行同样的处理，却发现既无Fas的表达也无DNA片段的产生，这表明由于雄性激素缺乏所导致的生殖管道退化是由Fas介导的凋亡触发的，而Bcl-2水平的下调是凋亡信号传导过程中最先发生和最关键的步骤之一。而Ogi[10]通过研究小鼠的隐睾模型发现，在lpr小鼠的睾丸中虽没有Fas的表达，隐睾时生殖细胞的凋亡也增加。故认为Fas虽然与生殖细胞的凋亡有关，但并非细胞凋亡的唯一途径。
（四）C-myc基因 它的表达既可以引起细胞增殖，又可促进细胞凋亡，这种相互对立的作用取决于关键生长因子的存在与否。当某些生长因子存在,C-myc可促进细胞大量C-myc增殖，反之则介导细胞进入凋亡状态。地C-myc转基因大鼠研究发现，C-myc基因的过度表达对雌性大鼠的生育能力无明显影响，但可以造成雄性大鼠的生育能力无明显影响，但可以造成雄性大鼠的不育，使大鼠睾丸的生精过程停滞于初级精母细胞的减数分裂阶段，并且发现不育大鼠初级精母细胞的DNA凋亡片段是增加的，这说明C-myc基因的过度表达导致处于减数分裂期的精母细胞凋亡而造成雄性大鼠的不育[19]。在某些情况下，C-myc基因的双相表达也可导致生精细胞凋亡。体外研究显示，棉酚可以诱导大鼠生精细胞发生凋亡，当生殖细胞与株酚接触后，首先出现C-myc表达水平明显下降，并维持在低水平约数小时，以后C-myc表达恢复到接触前水平，随之发生以精母细胞为主的凋亡，因此棉酚所致不育可能与C-myc介导的细胞凋亡有关[20]。
最新研究表明，ICE、Rb、p16、nm23等基因均与细胞凋亡的发生有密切关系，但有关它们与生精细胞关系的报道尚不确切。总之，睾丸生殖细胞的凋亡是一个多基因调控过程，各基因间的相互作用决定了细胞的生存与死亡。目前，有关生精细胞凋亡的研究主要局限于动物模型方面，对人类则了解甚少。深入研究睾丸生殖细胞的凋亡及其调控对指导男性不育的治疗及探索男性节育新途径具有重大的现实意义。
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(收稿日期：1999-02-01 修回日期：1999-04-18)
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