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一氧化氮在胃癌进展中的作用
中国普通外科杂志1999年7月第8卷第4期
邹益友 冯德云 伍赶球 郑晖
【摘要】 目的 探讨一氧化氮（NO）在胃癌发病过程中的作用。方法 42例经胃镜活检、病理检查证实为胃癌，采用地高辛标记的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA探针经原位杂交显示细胞内的iNOSmRNA的表达情况，并与癌周组织及浅表胃炎组织比较。结果 在42例胃癌患者，iNOSmRNA信号强阳性（＋＋＋）11例，中度阳性（＋＋）14例，低度阳性（＋）13例，可疑阳性（±）3例，阴性（－）1例；在癌周组织多为（±）或（－）；与浅表性胃炎相比，差异有高度显著性（P＜0．01）。结论 大多数胃癌患者的癌细胞内iNOSmRNA表达阳性，提示胃癌细胞自身能产生一氧化氮。
【主题词】:胃肿瘤／病因学腺癌／病因学 一氧化氮
【中国图书分类号】：R735.2 R730 R61
一氧化氮（NO）是生物体内近年来颇受关注的信息传递小分子，并与许多疾病发生发展过程有关。由于NO可引起DNA的损伤，导致基因突变，其氧化代谢产物亚硝酸盐（NO－2）是一个公认的致癌剂，加之在萎缩性胃炎（易发展为胃癌）观察到随着萎缩程度的加重胃液中NO－2显著增加，因此，在胃癌发生过程中可能包含NO机制［1］。目前认为，胃粘膜内NO来源于巨噬细胞和多形核白细胞［2］，而胃癌细胞自身能否产生NO尚不清楚。鉴于一氧化氮合酶（NOS）是形成NO的关键限速酶，为此，我们观察了胃癌细胞内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA（信使核糖核酸）的表达情况，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料及分组
（1）胃癌组 42例，均经胃镜检查及病理检查证实为胃癌。男20例，女22例，平均年龄49.9±13.5岁（26～72岁）。病理组织学类型：低分化腺癌28例（66.7％），印戒细胞癌5例（11.9％），中、高分化腺癌3例（7.1％），高分化腺癌2例（4.8％），低、未分化腺癌1例（2.4％），未分化腺癌1例（2.4％），中、低分化腺癌1例（2.4％），中、中分化腺癌1例（2.4％）。
（2）浅表性胃炎组 44例，均经胃镜检查及病理检查证实。男26例，女18例，平均年龄45.4±11.2岁（18～64岁）。与胃癌组比较，性别、年龄均无显著性差异（P＞0．05）。
1.2 试剂
地高辛配基标记的iNOSmRNA试剂盒系武汉博士德公司产品，蛋白酶K系德国E．Merck公司产品。
1.3 方法
1.3.1 iNOSmRNA原位杂交 按如下步骤进行：①石蜡切片常规脱蜡至水，3％H2O2室温处理10min以灭活内源性过氧化物酶；②切片滴加25mg／L的蛋白酶K，37℃消化15min，以暴露mRNA；磷酸盐缓冲液（PBS）清洗5min×3次；③杂交前的处理及杂交：将地高辛标记探针放入80～90℃水中变性10min，取出后立即插入碎冰中，保持3min。切片空气中干燥后，按每张切片加10μl地高辛记探针液，加盖杂交专用盖玻片，于37℃湿盒中杂交16～24h；④杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃2倍柠檬酸钠氯化钠缓冲液（2×SSC）洗涤5min×2次；37℃的0.1×SSC洗10min×1次，洗涤时间应予严格控制；⑤滴加封闭液，室温孵育20min，不洗；⑥滴加封闭液，室温孵育20min，不洗；⑦滴加鼠抗地高辛抗体于37℃温箱孵育30min，0.5MPBS洗5min×3次，勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤；⑧滴加生物素化羊抗小鼠IgG于37℃温箱孵育20min，0.5MPBS洗2min×3次，勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤；⑨滴加链青素标记的过氧化物4次，勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤；⑩二氨基联苯胺（DAB）显色，充分水洗；⑦酒精脱水，二甲苯透明，封片。
用缓冲液2×SSC代替探针作空白对照；用（RNase）37℃消化1h作阴性对照；以随试剂盒所附阳性片作阳性对照。
1.3.2 iNOSmRNA阳性信号强度评估 采用Fromowitz等［3］染色结果参照Fromowitz等的综合计分法并稍加改进作半定量分析（附表）。阳性细胞百分比即为某类细胞观5个视野（每个视野计数100个此类细胞）的阳性细胞平均数；而着色强度则以多数阳性细胞呈现的染色特征计分。
附表 原位杂交信号判定标准
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阴性细胞百分比计分 |
着色强度计分 |
| 百分比（％） |
计分 |
强度（颜色） |
计分 |
| 0 |
0 |
无 |
0 |
| ＜25 |
1 |
弱（淡黄） |
1 |
| 26～50 |
2 |
中（棕黄） |
2 |
| 51～75 |
3 |
强（棕褐） |
3 |
| ＞75 |
4 |
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注：两分相加，0分阴性（－），2～3分弱阳性（＋），4～5分中度阳性（＋＋），6～7分强阳性（＋＋＋）
1.4 统计方法
所有资料录入电脑的Office97Excel中，利用Excel97分析和处理资料。统计方法采用t或χ2检验。
2 结果
2.1 胃癌细胞及癌周细胞内iNOSmRNA
42例患者中有38例患者的胃癌细胞内可见棕褐色的iNOSmRNA标记物，阳性标记物分布于癌细胞的细胞质和／或细胞核，其中iNOSmRNA信号强阳性（＋＋＋）11例，中度阳性（＋＋）14例，低度阳性（＋）13例，可疑阳性（±）3例，阴性（－）1例。iNOSmRNA的表达强度与癌组织类型、患者年龄、性别无相关性；在癌周非癌细胞内iNOSmRNA多为（－）、（±）。
2.2 胃癌与浅表性胃炎细胞内iNOSmRNA阳性率
42例胃癌患者iNOSmRNA阳性率为90.5％（38例），44例浅表性胃炎患者iNOSmR-NA阳性率为9.1％（4例），两者差异有高度显著性（P＜0．01）。
3 讨论
NOS是NO产生的关键限速酶。在机体内，该酶分3种类型，即神经原性NOS、内皮细胞性NOS以及iNOS［4］。已经证明巨噬细胞、中性粒细胞、呼吸道上皮、肾小管上皮及内皮细胞等均有iNOS，mRNA。很可能在所有的组织中都产生iN-OS，并作为一种原始类型的免疫系统而起作用［5］，但胃癌细胞是否具有该酶活性尚未见报道。
一氧化氮（NO）是生物体内近年来颇受关注的信息传递小分子，并与许多疾病发生发展过程有关。通过细菌和人的培养细胞研究证实，NO能致DNA损伤，其机理可能有二［1］：①NO的氧化产物引起硫氧基团变构，产生致癌的亚硝胺类复合物或引起多胺重氮化，这一系列产物可通过脱胺或交联引起DNA或RNA碱基变构；②NO可能与O2反应生成过氧化亚硝酸（OONO－），后者分解为OH－和NO－2引起细胞包括核酸在内的广泛损伤，过氧化亚硝酸可直接将含巯基化合物氧化，引起DNA解链。在萎缩性胃炎（易发展为胃癌）观察到随着萎缩程度的加重胃液中NO－2显著增加，由此推测在胃癌发生过程中可能包含NO机制［1］，目前认为，胃粘膜内NO来源于巨噬细胞和多形核白细胞，进而引发胃癌［2］。但该观点似乎与巨噬细胞产生的一氧化氮具有抗肿瘤作用［6］的观点相悖。本组42例胃癌患者中有38例患者的胃癌细胞内及阳性对照片显示iNOSmRNA杂交信号，在癌周组织、绝大多数浅表性胃炎、空白对照及阴性对照片上未见iNOSmRNA杂交信号。结果表明，胃癌细胞表达iNOSmRNA，提示胃癌细胞本身能产生一氧化氮，并以其作为一种原始的防御机制来对抗机体清除作用。有研究表明，NO对LAK细胞（lymphokineactivatedkillercell）活性具有抑制作用［7，8］，该作用是否与胃癌的免疫逃逸有关，值得关注。
作者简介：邹益友，男，41岁，硕士，副教授，湖南医科大学附属湘雅医院消化科，410008 湖南省长沙市湘雅路141号
冯德云，郑晖，湖南医科大学病理教研室，410078 湖南省长沙市湘雅路88号
伍赶球，湖南医科大学组织胚胎教研室
参考文献（略）
（收稿日期：1999-01-20 修回日期：1999-03-25）
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