动脉成形术对血管表皮生长因子受体表达影响的免疫组化研究

　　第二军医大学学报1999年第20卷第4期

　　王兵　李玉莉　何金　张国元　芮耀诚　吴宗贵

　　摘　要　目的：观察动脉成形术对血管平滑肌细胞（SMC）表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响，探讨EGFR与再狭窄的关系。方法：于兔右颈总动脉成形术前及术后24，48，72h，7d和14d，取实验动脉段用免疫组化LSAB法检测EGFR的表达。结果：正常颈总动脉中膜未见EGFR阳性表达；动脉成形术后24h，中膜部分SMC显示EGFR阳性表达；48和72h中膜EGFR阳性表达均进一步增加；7和14d动脉中膜EGFR阳性表达的SMC均较72h显著减少，但新生内膜中增殖的SMC均显示大量EGFR阳性表达。阳性染色以胞膜处最明显。结论：动脉成形术使血管SMC EGFR表达显著增加，再狭窄形成过程中SMC增殖与EGFR有关。

　　关键词：动脉成形术　血管平滑肌细胞　表皮生长因子受体　免疫组织化学

　　经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）后6个月内再狭窄的发生率高达30%～50%^［1］，成为其应用的主要障碍。研究表明，再狭窄的主要病理机制是动脉中膜平滑肌细胞（SMC）对损伤的过度修复，表现为中膜SMC被激活，由收缩表型转化为合成表型，进而迁移至内膜下增殖并分泌细胞外基质^［2,3］。SMC激活是多种因素综合作用的结果，其中一些生长因子可能起主要作用，而生长因子又必须通过其相应受体介导发挥作用。本研究用免疫组化技术，观察动脉成形术对SMC表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响，拟探讨EGFR与再狭窄的相关性。

　　1　材料和方法

　　1.1　主要试剂　标记抗体SMActin和Desmin，Dako公司产品；兔抗鼠EGFR抗血清，中国科学院上海细胞生物学研究所徐永华教授惠赠；LSAB组化试剂盒，Dako公司产品。

　　1.2　动物及分组　取纯种新西兰雄性兔（第二军医大学实验动物中心提供）36只，体质量2.5～3.0kg，随机分为未损伤正常动脉组，损伤24，48，72h组、7及14d组，每组6只。

　　1.3　颈总动脉球囊内膜剥脱术　按文献［4］方法进行。

　　1.4　血管SMC的鉴定　各组随机取3个血管，常规10%甲醛固定，石蜡包埋，制成4μm切片，每个血管随机取1张切片，用免疫组化LSAB法以标记抗体SMActin和Desmin行血管SMC鉴定。

　　1.5　EGFR表达的免疫组化染色　各组每个动脉随机取不连续切片3张，用LSAB法行免疫组化染色。切片脱蜡；置0.3%H₂O₂的甲醛液中20min，去除内源性过氧化物酶；PBS洗后滴加正常猪血清(1∶10)，室温孵育30min；滴加兔抗鼠EGFR抗血清(1∶80)，4℃过夜，PBS洗；生物素标记的猪抗兔(1∶400)孵育30min，PBS洗；过氧化酶标记的链卵白素(Streptavidin 1∶400)30min，PBS洗；DAB-H₂O₂溶液显示后，苏木精复染，脱水，封片，光镜观察。阴性对照用PBS代替一抗。

　　2　结　果

　　2.1　血管SMC的鉴定　各组血管中膜排列整齐的梭形细胞及损伤7和14d组新生内膜中杂乱排列的胖梭形细胞，SMActin和Desmin免疫组化染色均呈棕黄色的阳性结果，提示均为SMC。

　　2.2　EGFR表达的免疫组化染色　正常颈总动脉中膜免疫组化未显示出棕黄色的阳性染色（图1）；动脉成形术后24h中膜部分SMC显示出棕黄色的阳性颗粒（图2），术后48h中膜呈棕黄色阳性染色的SMC较24h增加，72h又较48h进一步增加（图3）。在动脉成形术后72h内，中膜EGFR表达显著增加。动脉成形术后7及14d（图4）中膜呈棕黄色阳性染色的SMC数量相似，均较72h显著减少，但两组增厚的新生内膜中杂乱排列的增殖SMC均显示出大量的棕黄色阳性染色。阳性染色以胞膜处表达最明显。(图见封三)

图1　正常颈总动脉中膜EGFR表达

　　Fig 1　Immunohistochemical staining for EGFR expression in normal rabbit common carotid artery (LSAB method ×200)

2　颈总动脉成形术后24h中膜EGFR表达

　　Fig 2　Immunohistochemical staining for EGFR expression in rabbit common carotid artery 24h after angioplasty (LSAB method×200)

图3　颈总动脉成形术后72h中膜EGFR表达

　　Fig 3　Immunohistochemical staining for EGFR expression in rabbit common carotid artery 72h after angioplasty (LSAB method×200)

4　颈总动脉成形术后14d新生内膜EGFR表达

　　Fig 4　Immunohistochemical staining for EGFR expression in rabbit common carotid arterial neointima 14d after angioplasty (LSAB method×200)

　　3　讨　论

　　动脉成形术后再狭窄的发生机制尚未完全阐明，临床至今仍无有效预防措施，严重影响着PTCA的远期疗效。临床病理检查和动物实验均证实再狭窄斑块主要为增殖的SMC^［5，6］。业已证实，在动脉粥样硬化的形成和动脉内膜损伤后修复的过程中，EGF、血小板衍生生长因子（PDGF）、酸性或碱性成纤维细胞生长因子（aFGF or bFGF）、胰岛素样生长因子1 （IGF-Ⅰ）、IGF-Ⅱ、转化生长因子β（TGFβ）、白细胞介素1 （1L-1）和1L-6等生长因子和细胞因子促进了动脉SMC的增殖^［7］。

　　EGFR是广泛存在于哺乳类动物细胞表面的膜受体，是一种相对分子质量为1.7×10⁵的跨膜糖蛋白，由N端的胞外区、跨膜区和C端胞内区3部分组成，它通过胞外区的配体结合结构域可以和EGF或转化生长因子α（TGFα）特异性结合，传递生长因子的信号，影响细胞的生长或分化^［8］。EGFR的蛋白激酶结构域和癌基因V-erbB1高度同源，人EGFR基因定位在第7号染色体上，若将病毒的启动子或激活子插入细胞基因，可将EGFR基因变成癌基因。EGFR膜内部分有一个由250个氨基酸残基组成的片段，该片段与癌基因sac族酪氨酸蛋白激酶的结构相似，推测EGFR具有酪氨酸蛋白激酶活性，可能在特殊情况下不需与配体结合就处于激活状态，从而使细胞内蛋白质的酪氨酸基磷酸化，产生细胞分裂信号^［9］。

　　研究表明，离体培养的增殖期SMC能高水平地表达EGFR，而静止期SMC的EGFR表达水平较低^［7］。本研究进一步证实了正常动脉SMC EGFR表达水平较低，在动脉成形术后72h内，中膜EGFR表达显著增加，7和14d中膜EGFR表达显著减少，但新生内膜中大量增殖的SMC均高水平地表达EGFR，EGFR主要定位于SMC的胞膜。本研究用EGFR抗血清和免疫组化方法显示除了胞膜表达外，胞质表达也是常见的现象。有关胞质内受体的来源尚不明确，据分析这种胞质内受体可能代表内化的受体、新合成尚需进一步加工和插入胞膜的受体或仅由受体胞质区组成的截断性受体。在EGF不存在时，EGFR随机分布在质膜上，当EGF存在时，受体迅速集聚在被膜小凹内，并内化进入细胞内形成受体颗粒（receptorsomes），然后出现在与高尔基体相关的被膜结构内，最后在溶酶体内降解，EGFR也随之下调。内化的受体少部分在溶酶体内降解，绝大部分重新循环到细胞表面。血管成形术后，SMC类似肿瘤细胞能摆脱机体正常调控而自主性生长及高水平地表达EGFR，EGFR基因扩增、重排或转录控制异常可能是重要原因之一^［9］。动脉成形术后，增殖期SMC高水平表达的EGFR可以成为抑制其增殖的攻击目标，本研究为再狭窄机制的探讨及药物预防研究提供了实验依据。

　　国家自然科学基金资助项目，批准号39670316

　　作者单位：王兵　张国元　吴宗贵　第二军医大学长征医院心血管内科，上海，200003

　　李玉莉　何金　第二军医大学长征医院病理科

　　芮耀诚　第二军医大学药学院药理学教研室

　　作者简介：王兵，男，1966年2月生，博士主治医师，现在第二军医大学长征医院肿瘤科

　　参 考 文 献

　　[1]　Rozenman Y,Gilon D,Welber S,et al.Total coronary artery occlusion late after successful coronary angioplasty of moderately severe lesions:incidence and clinical manifestation.Cardiology,1994,85(3/4):222

　　[2]　Riessen R,Isner JM.Prospects for site-specific delivery of pharmacologic and molecular therapies.J Am Coll Cardiol,1994,23(5):1234

　　[3]　Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s.Nature,1993,362(6423):801

　　[4]　王兵，李玉莉，关战军，等.TGF_α-PE40对兔颈总动脉损伤后内膜增生的抑制作用.第二军医大学学报，1998，19(2)：165

　　[5]　Miano JM,Vlasic N,Tota RR,et al.Smooth muscle cell immediate-early gene and growth factor activation follows vascular injury.A putative in vivo mechanism for autocrine growth.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1993，13(2):211

　　[6]　Morimoto S,Mizuno Y,Hiramitsu S,et al.Restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty——a histopathological study using autopsied hearts.Jpn Circ J,1990,54(1):43

　　[7]　Epstein SE,Siegall CB,Biro S,et al.Cytotoxic effects of a recombinant chimeric toxin on rapidly proliferating vascular smooth muscle cells.Circulation,1991,84(2):778

　　[8]　Epstein SE,Speir E,Unger EF,et al.The basis of molecular strategies for treating coronary restenosis after angioplasty.J Am Coll Cardiol,1994,23(6):1278

　　[9]　徐永华.细胞生长因子和受体.生命的化学，992,12（4）：4