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胶原包埋聚羟基乙酸构筑血管模型
第四军医大学学报1999年第20卷第11期
熊猛 王飏 艾玉峰 张琳西
摘 要 目的: 通过用交联胶原包埋处理聚羟基乙酸（Polyglycolic acid, PGA），形成胶原加聚羟基乙酸管形支架，并接种牛血管内皮细胞于其内腔面，观察内皮细胞生长分化情况.方法: 采用酶消化法从牛主动脉中分离培养牛血管内皮细胞并传代、纯化，将聚羟基乙酸无纺网用胶原溶液包埋，真空冷冻干燥，形成多孔状PGA+胶原管型支架；接种3代～7代牛血管内皮细胞于其内腔面，采用动态旋转培养技术体外培养10 d，行扫描电镜观察.结果: 该支架具有一定弹性和韧性，在培养液中，能较长时间保持形状. 内皮细胞在其内表面形成较完整内皮细胞层. 覆盖率约72.6%±3.5%.结论: 此支架可以作为组织工程技术并造血管的较理想支架之一. 此方法为进一步应用组织工程方法构筑具有分层结构的人造血管打下基础.
关键词：组织工程 聚羟基乙酸 血管
0 引言
人们长期以来一直在寻找血管的最佳替代品，尝试了人工材料［1］，生物材料［2］，以及人工材料与生物材料的复合材料［3］等多种方法，但上述方法对于小口径（＜1 cm）血管远期效果均不理想. 组织工程技术的出现使体外培植具有生物活性，且在结构和功能上与自体血管相类似的人工血管成为可能. 我们采用牛骨Ⅰ型胶原包埋处理聚羟基乙酸无纺网，形成血管支架材料，并接种牛血管内皮细胞于其内腔面，观察内皮细胞的生长分化情况，为组织工程再造血管提供一个新思路.
1 材料和方法
1.1 材料 乙酸（分析纯）（西安化学试剂厂）， PGA
纤维无纺网（DAVIS-GICK，USA）， 胃蛋白酶（Sigma，国内分装)，戊二醛溶液（上海生化试剂厂， 进口分装）， 透析袋（华美生物工程公司）， 序列冻干机（FTS，USA），胶原酶（Ⅰ型）（Sigma, NO C0130）， RPMI-1640培养液（Gibco， USA），小牛血清（杭州四季青生物制品公司），培养瓶（Nunclone，Co），BB16型CO2培养箱（Heraeus 上海）， SW-CJ-1B超净工作台（苏净集团），倒置显微镜（Olympus, Japan），ⅤⅢ因子相关抗原抗体（Zymed）， LG10-3A低温高速离心机（北京医用离心机厂），JSM-840扫描电镜（JEOL，日本电子株式会社）.
1.2 方法
1.2.1 牛骨Ⅰ型胶原的提取 采用提取BMP（骨形态发生蛋白）后废弃的中间产物-骨渣中提取胶原［4］. 将骨粉加入其10倍体积的0.5 mol/L乙酸溶液，并加入活力为1∶2 500的胃蛋白酶，磁力搅拌72 h，静置24 h，过滤细小骨渣，取上清，采用两步盐析法（上清液前后加入0.7 mol/L，1.2 mol/L NaCl溶液中盐析,静置24 h，15 000 g，离心20 min）收取沉淀，将上清液装入透析袋内，PBS缓冲液（pH 7.4）反复透析96 h，以上步骤均在4℃下操作. 透析后胶原经浓缩处理，取1 mL样品烘干称重，计算胶原浓度及提取量. 取胶原样品行聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），浓缩胶6%，分离胶8%，聚合后加样，在Tris-甘氨酸缓冲液中电泳1 h固定，考马斯亮蓝作区带染色，marker采用Sigma公司Ⅰ型标准胶原.
1.2.2 胶原包埋处理聚羟基乙酸支架 将市售250 mL/L戊二醛（GA）经常压蒸馏提纯后，测终浓度为110 g/L，向提取的胶原浓液中滴入戊二醛溶液，使戊二醛终浓度为0.6 mL/L［5］. 将直径15 μm的聚羟基乙酸纤维无纺网（polyglycolic acid， PGA）与交联胶原溶液相混合，注入一带有中轴的特制模具中，置于序列冻干机中真空冷冻干燥24 h，用10号长针头将其从模具上仔细剥离下来，即得到多孔状PGA+胶原的管型支架，无菌Tris-HCl缓冲液漂洗7 d，自然干燥，60Co照射12 h灭菌备用. 管形支架沿中轴剖开，一分为二，表面干燥，固定，喷金，行扫描电镜观察.
1.2.3 牛血管内皮细胞的接种 采用3～7代生长状态良好，稳定的牛血管内皮细胞，经2.5 g/L胰酶消化，计数细胞悬液浓度3×108/L，将细胞悬液注入管型支架管腔内，RPMI-1640培养液浸设，置于37℃孵箱中，每30 min旋转90°，重复4 h，以后每12 h旋转180°，培养10 d. 样品用30 mL/L戊二醛固定，沿中轴剖开，一分为二，经脱水，干燥，喷金后行扫描电镜观察.
2 结果
原代牛血管内皮细胞在倒置显微镜下呈特征性鹅卵石样形态［6］，排列致密，胞质丰满，反光较强，特别在核周区. 细胞核呈圆形或长圆形，有1到数个核仁，经多次传代或冻存复苏后，细胞形态会有所改变，呈长梭形或多角形（Fig 1）. 经ⅤⅢ相关抗原抗体染色，阳性着色位于胞质内，细胞核周围（Fig 2）.
图 1 培养的牛血管内皮细胞形态
fig 1 The phenotype characterization of the passage culture boving endothelial cells ×100
图 2 Ⅷ因子相关抗体染色呈强阳性
fig 2 The cells layer displayed strong positive staining for Ⅷ factor antigen ×200
提取胶原呈透明胶冻状，经浓缩调整后浓度为20 μg/L，骨渣(湿重)中提取量约为2.4 g/kg,SDS-PAGE凝胶电泳显示蛋白条带与Sigma公司Ⅰ型标准品胶原大致相同,证实其主要成分为Ⅰ型胶原［7］. 管形PGA+胶原支架长1.5 cm～2 cm，外径1 cm，内径0.8 cm，呈白色，质地均匀，柔韧，固定成形，具有一定弹性，放置培养液中10 d，可保持管腔形状，不塌陷，不变形. 扫描电镜示支架呈多微孔结构，网孔均匀一致，胶原为主要结构基质，PGA纤维呈不规则交错缠绕，具有支架的作用(Fig 3，4).
图 3 管形支架材料形态(Ⅰ)
fig 3 The phenotype characterization of tubular scaffold material
图 4 管形支架材料形态(Ⅱ)
fig 4 The phenotype characterization of tubular scaffold material
扫描电镜示血管内皮细胞在管形PGA+胶原支架内表面贴附情况良好，细胞伸展，伪足明显，具有良好活性，细胞较快地扩展融合成片，经过10 d培养，在管形支架内腔面形成较完整的内皮细胞层，经计算机图像分析处理，覆盖率达72.6%±3.5%(n=3)（Fig 5， 6）.
图 5 扫描电镜示管形材料内表面内皮细胞形成较完整的内膜层
fig 5 Endothelial cells forming confluent monolayers on tubular scaffold inner surface EM ×500
图 6 扫描电镜示管形材料内表面内皮细胞形成较完整的内膜层
fig 5 Endothelial cells forming confluent monolayers on tubular scaffold inner surface EM ×1 000
3 讨论
胶原分子主体结构为杆状三螺旋结构，末端被认为是引起免疫反应主要原因，处理过程中加入骨蛋白酶，即可破坏胶原巨分子结构，又可切除末端三肽，增加胶原溶解性，又降低免疫源性［5］. 胶原为血管的主要结构蛋白，以Ⅰ型为主，我们采用两步盐析法提取牛胶原，经鉴定主要以Ⅰ型为主，方法简便，浓度较高，可以满足实验所需.
聚羟基乙酸（PGA）是一种新型生物降解材料，具有在体内代谢产物无毒，无蓄积，有较好的生物相容性，已被广泛用于可吸收缝线，药物缓释系统的载体等，PGA降解速度受许多因素控制，体内降解一般需8 wk～12 wk. 胶原也是近年来研究较多的生物降解材料，但外源性胶原在体内受细胞分泌的胶原酶作用降解较快，通过加入戊二醛来增加胶原的交联程度［8］，戊二醛能促进胶原分子中赖氨酸与赖氨酸ε-氨基形成分子内和分子间共价链，形成交联密度较高，稳定性较好，密集的结构可延缓胶原的降解，具有较强的抗酶解作用.
胶原具有良好的生物相容性和粘接成形性，但单纯胶原的机械强度不足，我们采用胶原加PGA相复合，构成复合生物可降解材料，胶原构成主要结构基质，PGA纤维纵横交错，构成支架作用，具有一定的弹性与韧性，放置于液体环境，可长时间维持管腔形状，扫描电镜下呈现多微孔结构，网孔较均匀一致，多微孔结构即有利于二期血管平滑肌细胞的种植长入，又可增加支架的弹性，以达到组织工程血管与自体血管弹性匹配的目的，以减少吻合口血栓，内膜增生等情况.
血管内皮细胞在管形支架内表面贴附生长良好，说明该支架材料具有良好的生物相容性及细胞吸附力，适合于血管内皮细胞的生长，经过10 d体外培养，可形成较完整的内膜层，已经具备了血管的雏形.
每年在美国，约有140万患者需要血管置换，其中绝大多数需要口径＜6 mm的血管. 组织工程是一个飞速发展的学科，利用组织工程再造血管应用前景广阔. 采用胶原包埋处理PGA管形支架，可以成为组织工程技术再造血管的较理想支架之一，此方法构筑小口径血管的雏形，为进一步工作打下基础.
作者简介：熊 猛，男，1972-05-08生，甘肃省兰州市人，汉族，1995年第四军医大学医疗系本科毕业，在职硕士研究生. 电话：（029）3375305作者单位：（第四军医大学西京医院整形外科中心, 陕西 西安 710033）
参考文献
1 Gherardini G, Haegerstrand A, Matarasso A et al. Cell adhension and short-herm patency in human endothelium preseeded 1.5 mm polytetrafluoroelylene vascular grafts:An Experimental study. Plast Reconstr Surg, 1997; 99(2):472-478
2 Crispin BW, Eugene B. A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells. Science, 1986; 231(24):397-400
3 Takenisa M, Takane K, Hiroo I et al. Hybrid artifical vascular graft based upon an organ reconstruction model. ASAIO, 1988;34(2):640-643
4 丁真奇. 骨胶原的制备及作为骨形成蛋白载体修复骨缺损的研究. 骨与关节损伤杂志，1996;11（5）：290-293
5 李成章，樊明文. 冻干交联胶原膜的制备特性分析，口腔医学纵横杂志，1996;12（3）:135-137
6 司徒镇强，吴军正主编. 细胞培养. 西安:世界图书出版公司, 1996:58-125
7 李成章，樊明文. 胚胎骨Ⅰ型胶原的提取与鉴定. 生物化学与生物物理进展, 1996;23（4）：373-375
8 Hyder PR, Dowell P, Freeze-dried cross-linked bovine type 1 collagen: Analysis of properties. J Periodontol, 1992;63(3):182-185
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