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正常及PNH患者中性粒细胞氧化杀菌功能与其表面FcγRⅢb(CD16b)关系的探讨
中华血液学杂志 1998年第1期第19卷 研究报告
作者：傅新容 崔毅 许彩民 潘华珍 张之南
单位：100005 中国医学科学院基础医学研究所、协和医科大学基础医学院、 医学分子生物学国家重点实验室(傅新容、许彩民、潘华珍)；美国印地安那大学(崔毅)；北京协和医院(张之南)
本课题受国家自然科学基金(39770334)、卫生部基金(96-1-037)及美国CMB基金资助
中性粒细胞(PMN)是机体防御系统的主要组成部分，能吞噬和杀灭多种致病原。致病原与血清中的特异性抗体(IgG)结合后,通过IgG的Fc部分与PMN表面的受体——FcγRⅢ(CD16b)相结合，从而被吞噬。FcγRⅢ有a、b两种类型，FcγRⅢa(CD16a)是一种跨膜糖蛋白，PMN表面的FcγRⅢb(CD16b)是一种糖肌醇磷脂蛋白(GPI-锚蛋白)［1］。近年发现阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者在血细胞表面缺失各种特异的GPI-锚蛋白，CD16b正是这类蛋白之一。为探讨PMN表面CD16b的缺失与PMN释放氧自由基杀菌功能的关系，将我们的研究报告如下。
材料和方法
1 标本采集 正常人外周血取自协和医院血库正常献血者，正常骨髓取自协和医院胸外科手术患者的肋骨，PNH患者按1987年全国溶血性贫血会议拟定的诊断标准，并经流式细胞仪免疫荧光法检测CD59标记率进一步确诊。
2 中性粒细胞的分离 新鲜的外周血或骨髓，用肝素抗凝，经淋巴细胞分离液分离，去除淋巴细胞和单个核细胞，用右旋糖酐(dextran，分子量=7～11万)沉降和低渗法去除红细胞，得到纯净的中性粒细胞。用台盼蓝染色法检查细胞活力，须保证细胞存活率大于95%。
3 间接免疫荧光法检测CD16 取1×106个细胞，悬浮于100μl2% BSA中，室温封闭30分钟，加 CD16单克隆抗体(Immunotech sA公司产品)，在室温作用30分钟后，用PBS洗涤2次，再悬浮于100μl2％BSA中，加FITC 标记的羊抗鼠IgG(Gibco公司产品)室温暗染20分钟后洗去二抗。用500μl pBS悬浮细胞，用流式细胞仪检测CD16 标记率。
4 中性粒细胞功能测定 佛波醇酯(PMA，Sigma产品，用DMSO溶解，配制成1mg/ml，储存于－20℃，临用前稀释)能激活中性粒细胞，使之释放活性氧，其中O-2*和H2O2能与化学发光剂Luminol(3-氨基苯二甲酰肼，北京化工厂)反应而发光。用LKB-1250发光仪(Luminometer)检测。正常人和PNH患者中性粒细胞，制备成细胞悬液(107/ml)与 100nmol/L PMA 反应，37℃15分钟,置于冰上终止反应，取含1×105细胞的激活液加入到1ml 0.1nmol/L 的Luminol溶液中，立即测定发光值，每一数值测定3次以上，取平均值。取正常人的不同细胞数，测定发光值，结果显示发光值与细胞数有良好的线性关系，说明此方法具有可靠性(附图)。
附图 细胞数与发光值的线性关系
5 细胞培养 以 1×106个细胞/ml的密度接种PMN于IMDM培养基(含10%自身血清)，37℃、5% cO2分别培养12，16，20小时。
6 细胞形态学观察 不同培养时间的细胞用瑞氏染色，光学显微镜下观察。
7 DNA含量分析 取细胞1×106，PBS洗2遍，以70%冷乙醇(4℃)固定12小时以上，用PBS洗去乙醇，加入0.5ml柠檬酸-磷酸缓冲液(pH7.8)室温作用5分钟，离心后以PBS重悬细胞，加入 RNaseA (终浓度60μg/ml)37℃作用30分钟，再加入碘化乙锭(PI，终浓度50μg/ml)4℃暗染30分钟，以染细胞内总DNA，用流式细胞仪分析正常细胞和凋亡细胞，计算凋亡率。
结 果
1 形态学观察 新鲜外周血分离出的中性粒细胞有典型的分叶核，经培养后，形态出现一系列凋亡细胞特性的形态学改变。培养12小时，细胞体积变小，胞浆浓缩，核浓缩；培养16小时以后，部分细胞聚集成团，细胞核碎裂成小块，胞浆中出现空泡，凋亡小体形成。培养时间越长，光镜下可见的凋亡细胞比率越高。
2 中性粒细胞培养过程中CD16的标记率随时间的延长逐渐降低，而凋亡率逐渐增加，中性粒细胞的功能则呈明显的下降趋势，结果见表1。
表1 体外培养不同时间的正常外周血中性粒细胞的几项指标比较
| 培养时间
(小时) |
CD16标率
(%) |
流式仪检测
凋亡率(%) |
发光频率
(次/分) |
| 0 |
99.5 |
1.2 |
124.32 |
| 12 |
64.4 |
29.5 |
67.27 |
| 16 |
30.0 |
39.4 |
45.43 |
| 20 |
18.1 |
64.0 |
30.18 |
3 PNH患者的PMN释放超氧功能与正常人相比有显著的差异，结果见表2。
表2 PNH患者骨髓与正常骨髓中性粒细胞几项指标的比较
| 组别 |
例
数 |
CD59标记率
(%) |
CD16标记率
(%) |
发光频率
(次/分) |
| 正常组 |
10 |
＞95.00 |
＞95.00 |
117.16±11.47 |
| PNH组 |
5 |
13.60±4.26 |
2.44±0.98 |
44.82±16.52 |
| P值 |
|
＜0.001 |
＜ 0.001 |
＜ 0.001 |
讨 论
Ravetch等［1］报告CD16有变异型分布在不同细胞。CD16a分布在巨噬细胞和NK细胞表面，是跨膜蛋白；CD16b仅存于PMN，是GPI锚蛋白。我们应用CD16单抗检测CD16b在PMN表面的量。
PMN的杀菌功能涉及许多方面，有氧化型和非氧化型因素。本实验用不依赖于Fc受体的激活剂PMA来激活PMN，应用发光法测定氧自由基，包括O-2*、H2O2及OH-，测定时，加入PMN激活液即刻连续记录1分钟，以发光最高值计算，代表PMN受刺激后的即刻反应，反映释放氧自由基的能力，氧化型杀菌的功能。
PNH是造血干细胞PIG-A基因突变引起的克隆病，不同患者的异常血细胞GPI-锚蛋白缺失情况有很大差异，Schubert等［2］报道，PNH患者CD16缺失较CD59更明显，我们也观察到这个现象(结果见表2)，而且发现骨髓中PMN cD16b阴性细胞比外周血多，因此选择了PNH患者骨髓的PMN作为研究对象，并且我们所选择的都是病情较严重，病态细胞率高的病例(以CD59的标记率为标准)，因此结果更具有可靠性。
从以上结果得知CD16b表达量低的PNH患者，PMN释放氧的能力亦低，两者有平行的关系。为了进一步证实它们的相关性，应用正常人PMN在体外培养，也获得同样的结果。在培养过程中CD16b逐渐减少，释放氧自由基的功能也降低，两者有相伴关系。Hunizinga等［3］也曾发现在PMN激活的同时有CD16b的丢失。
根据Dransfield等［4］的报道，随CD16b表达量的下降，PMN逐渐凋亡。所以在PMN体外培养的同时又观察了其凋亡的情况。从形态及DNA含量变化，证实在CD16b表达量降低，释放氧自由基功能降低的同时，细胞出现凋亡，凋亡程度与其两项指标降低程度同步。
总之，正常人PMN在凋亡过程中CD16b减少的同时，释放氧自由基的功能也降低；PNH患者CD16b减少，释放氧自由基也减少，至于两者之间有何内在关联，有待进一步研究。但至少从另一个侧面说明PNH患者PMN表面CD16b缺失，使受体介导的特异性识别吞噬病原菌的功能下降；释放活性氧减少以致氧化杀菌功能降低，这两方面可能是PNH患者易受感染的原因。
参 考 文 献
1 Ravetch,JV,Perussia B.Alternative membrane forms of fcγRⅢ (CD16)on human natural killer cells and neutrophils.J Exp med,1989,170:481-497.
2 Schubert J,Alvarado M,Ucicechowski P,et al.Diagnosis of PNH using immunophenotyping of peripheral blood cells.Br J Haematol,1991,79:487-492.
3 Hunizinga TWJ, van der Schoot CE,Jost C,et al.The PI-linked FcγRⅢ is released on stimulation of neutrophils.Nature,1988,333:667-669.
4 Dransfield I,Buckle AM,Savill JS,et al.Neutrophil apoptosis is associated with a reduction in CD16(FcγRⅢ) expression.J immunol,1994,152:1254-1263.
(收稿：1997-03-21 修回：1997-07-23)
(校对：王汝瑞)
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