血清sTNF-R　TNF水平与系统性红斑狼疮关系的研究

中华风湿病学杂志 2000年第3期第4卷 临床研究

作者：李萍　赵丽娟　曹建平

单位：李萍（110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院风湿免疫科)；赵丽娟（110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院风湿免疫科)；曹建平（沈阳军 区总医院医学实验科)

　　在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)的发病过程中，多种细胞因子参 与其免疫病理损伤过程，但对反映免疫调节功能具有重要意义的可溶性肿瘤坏死因子受体(s TNF-R)与SLE关系的研究，国外报道甚少，国内尚未见到有关报道。肿瘤坏死因子(TNF)是 在SLE的炎症与自身免疫反应中起重要调控作用的细胞因子，在体内外可激活T、B淋巴细胞 ，诱发炎症反应，与SLE的发生和转归密切相关，而TNF的所有生物学效应是通过靶细胞上的 肿瘤坏死因子受体(TNF-R)而发挥作用的^［1］。因此为了研究SLE患者在发病过程中 血清sTNF-R、TNF-α与TNF-α/sTNF-R比值是否有改变以及这种变化对SLE发病机制、病 情活动的影响，本文以双抗体夹心ELISA法测定了50例SLE患者和30名健康人血清sTNF-RⅠ 、sTNF-RⅡ及TNF-α、TNF-α/sTNF-R的水平，现将结果报道如下。

　　1　资料与方法

　　1.1　研究对象

　　50例住我院SLE患者，符合1982年美国风湿病学会的SLE分类标准，男性5例，女性45例，平 均年龄(31±12)岁(14～60岁)，平均病程(2.6±1.4)年(4个月～6年)。其中30例为活动期 SLE患者，对疾病活动度的评价采用改良1992年欧洲SLE活动性评分标准，凡积分≥3分者认 为病情活动，20例为稳定期SLE患者。健康对照组30名，男2名，女28名，平均年龄(30±8) 岁(18～48)岁，来自我市健康献血员。病人组与对照组年龄、性别构成比在统计学上差异无 显著性。

　　1.2　实验方法

　　1.2.1　主要试剂及仪器：双抗体夹心ELISA人sTNF-RⅠ、sTNF-RⅡ试剂盒(购自深圳晶 美生物工程有限公司)。双抗体夹心ELISA人TNF-α检测试剂盒(军事医学科学院产品)。美 国伯乐3550酶标仪。

　　1.2.2　标本的采集及处理：晨起空腹取肘正中静脉血3 ml，置于EDTA抗凝管中，在4 h内 离心，3 000 r/min，10 min，收集上清然后加蛋白酶抑制剂苯甲基氟磺酸(PMSF)10 μl， 封闭于Eppdoff管内－20 ℃保存待检。

　　1.2.3　sTNF-RⅠ、sTNF-RⅡ的检测(ELISA法)：将已包被了抗sTNF-RⅠ单抗或抗sTNF -RⅡ单抗的酶标板在室温中平衡20 min。sTNF-RⅠ标准品的稀释：sTNF-RⅠ冻干标准品 含sTNF-RⅠ 4 000 pg 以标准品/标本稀释液1.0 ml复溶后浓度为4 000 pg/ml，倍比稀释 成4 000、2 000、1 000、500、250、125、0 pg/ml。sTNF-RⅡ标准品的稀释：sTNF- RⅡ冻干标准品含sTNF-RⅡ 4 000 pg，用标准品/标本稀释液1.0 ml进行复溶，静置15 mi n，混匀，复溶后浓度为4 000 pg/ml，再用标准品/标本稀释液倍比稀释成2 000、1 000、5 00、250、125、0 pg/ml。加入标准品稀释液100 μl至空白孔和零孔，加入标本和已稀释为 不同浓度的标准品各100 μl至相应孔中，标本和各浓度标准品均设复孔。37 ℃、90 min然 后用洗涤液洗板3次。除空白孔外，每孔加1∶100稀释的生物素化二抗100 μl，37 ℃ 、60 min，洗板3次。除空白孔外，每孔加1∶100稀释的酶联物100 μl，37 ℃ 20 min ，洗板3次，每孔加底物A、B各50 μl，避光37 ℃ 15 min。每孔加终止液1滴，即刻在450 nm处读数。绘制标准曲线：以sTNF-RⅠ、sTNF-RⅡ的标准品浓度作横坐标，A值作纵 坐标，以平滑线连接各标准品的标点，通过标本的A值可在标准曲线上查出浓度。TNF- α的检测：按试剂盒说明书进行。

　　1.2.4　治疗措施：30例患者完成激素加免疫抑制剂治疗。强的松剂量每日1～1.5 mg/kg 。免疫抑制剂为环磷酰胺(CTX)冲击治疗(CTX 0.4～0.6 g，2周一次)。每例平均完成2次 以上的CTX冲击，持续治疗时间6周以上。

　　1.3　统计学处理

　　实验数据用t检验及相关性分析。

　　2　结果

　　2.1　活动期、稳定期SLE患者与健康对照者血清sTNF-RⅠ、sTNF-RⅡ水平及TNF-α、TN F-α/sTNF-R水平比较：见表1。

表1　活动期 稳定期SLE患者与健康对照组血清

　　sTNF-RⅠ sTNF-RⅡ TNF-α TNF-α/sTNF-R 水平的比较(±s)　ng/ml

　　2.2　SLE患者治疗前后sTNF-RⅠ、sTNF-RⅡ、TNF-α、TNF-α/sTNF-R的 变化：见表2。

表2　SLE患者治疗前后sTNF-RⅠ sTNF-RⅡ TNF-α

　　TNF-α/sTNF-R的变化(±s)　　ng/ml

　　2.3　SLE患者血清sTNF-RⅠ、sTNF-RⅡ水平与TNF-α、疾病活动性的关系：见表3。

表3　SLE患者血清sTNF-RⅠ sTNF-RⅡ水平与SLE疾病

　　活动积分 抗ds-DNA 补体C3 TNF-α的关系

　　2.4　患者TNF-α/sTNF-R的比值：SLE重危患者TNF-α/sTNF-R的比值(77±9)明显高于SLE轻中度患者的比值(44±9)，差异有非常显著性(P＜0.01)。

　　3　讨论

　　近年研究表明，TNF、mTNF-R和sTNF-R共同组成一个复杂的生物学系统，参与自身免疫病 的病理生理过程^［2］，其中sTNF-R与自身免疫性疾病的关系正受到广泛关注。现已 明确TNF有两类重要受体即TNF-RⅠ与TNF-RⅡ。分子量分别为55 000和75 000，二者广泛 分布于肿瘤细胞和正常细胞膜表面。TNF-RⅠ主要分布于所有对TNF-α细胞毒作用敏感的 细胞及激活的T、B淋巴细胞表面。TNF-RⅡ主要分布于骨髓源性细胞及上皮细胞表面。这样 由于各种细胞表达TNF-R存在以上差异，使得TNF对各种细胞的作用不同，由此表现出其功 能的多样性^［3］。作为全身性自身免疫病的代表，SLE的免疫反应异常表现多种多样 ，主要由于某些内外因素的作用，非特异地激活了T、B淋巴细胞，介导了机体的自身免疫性 损伤。Erickson等^［4］的实验证明：静止期的T、B淋巴细胞表面不表达或很少表达T NF-R，只有淋巴细胞被抗原刺激后活化的细胞膜上才表达TNF-R。细胞膜TNF-R可释放到 血液中成为sTNF-R。因此，sTNF-R的测定可作为推测淋巴细胞是否被抗原激活的指标之一 。本实验结果显示：活动期SLE患者和稳定期SLE患者血清sTNF-RⅠ、sTNF-RⅡ水平明显高 于健康对照组(P＜0.01)。活动期SLE患者血清sTNF-RⅠ、sTNF-RⅡ、水平明显高于 稳定期SLE患者，P＜0.01。这表明在SLE患者血循环中被激活的T、B淋巴细胞是sTNF- R水平增高的一个主要来源，且sTNF-R水平升高是SLE病情活动的标志之一。本实验结果还 显示：稳定期SLE患者sTNF-R水平明显高于健康对照组(P＜0.01)。这与Aderka等 ^［5］的报道一致。该结果可能提示稳定期SLE患者淋巴细胞也处于活化状态，但其活化程 度明显低于活动期SLE患者，却比健康人显著增高。至于缓解期高水平的sTNF-R对疾病的复 发有无预测价值，有待于进一步观察。

　　本实验亦比较了SLE患者血清sTNF-R水平与用于监测SLE疾病活动性的其他指标的关系时发 现，活动期SLE患者血清sTNF-R水平与抗ds-DNA抗体水平、疾病活动积分指数呈显著正相 关(P＜0.01)，与补体C3水平呈显著负相关(P＜0.01)。这些结果提示，sTNF-R 水平为判断SLE患者疾病活动性提供一个较为客观、可靠的实验室指标，也进一步表明在监 测SLE患者病情变化时， 同时检测血清sTNF-R、抗ds-DNA、补体C3较之单独检测其中一项 更有意义。本实验结果和文献［5］报道一致。

　　我们的实验发现：SLE患者血清TNF-α、TNF-α/sTNF-R比值显著高于健康对照组，活动 期SLE患者血清TNF-α、TNF-α/sTNF-R比值显著高于稳定期SLE患者。经激素和免疫抑制 剂(CTX)治疗后，血清sTNF-RⅠ、sTNF-RⅡ、TNF-α水平、TNF-α/sTNF-R比值显著下 降。这表明激素及免疫抑制剂可直接抑制或杀伤激活的免疫活性细胞，降低sTNF-RⅠ、sTN F-RⅡ、TNF-α水平、TNF-α/sTNF-R比值，对于缓解和控制病情有积极意义。因此，sT NF-RⅠ、sTNF-RⅡ、TNF-α/sTNF-R比值测定也可作为判定SLE治疗效果的一项有意义的 指标。

　　生理水平的TNF和sTNF-R保持着动态平衡以维持机体内环境的稳定，当机体受抗原刺激后， 免疫细胞活化，TNF的合成与分泌增加，诱导mTNF-R脱落，使sTNF-R增加，sTNF-R与mTNF -R竞争结合TNF，使TNF与mTNF-R结合降低，从而降低了TNF的活性。因此，SLE患者血清sT NF-R的高水平也反映了机体针对高TNF的自我保护作用，是一种免疫自稳现象^［6］ 。目前已有研究发现TNF-α/sTNF-R比值的失衡与临床上一些炎症性疾病的病情及预后密 切相关。我们的实验也发现：当SLE患者血清TNT-α小于0.55 mg/ml时，sTNF-RⅠ、sTNF -RⅡ随着TNF-α水平的升高而成比例地增加，P均＜0.05。但是当TNF-α大于0.55 ng/ml时，sTNF-RⅠ、sTNF-RⅡ不随TNF-α水平升高而成比例地增加，P＞0.05。 若sTNF-R与TNF-α同时升高则预后较好，若TNF-α水平明显超过sTNF-R，则预后较差， 提示病情危重。这说明随着病情发展到一定阶段，sTNF-R水平虽然升高，但实际已陷入相 对不足状态，不能充分拮抗TNF的毒性效应，导致TNF-α/sTNF-R比值明显增大。所以，TN F-α/sTNF-R比值不仅对判定SLE的病情活动、监测治疗有一定意义，而且对于判定SLE的 预后有重要参考价值。现已证实^［7］两类重组sTNF-R在体内、体外都能中和TNF -α诱导的细胞毒性和免疫反应，可望应用于治疗自身免疫疾病，因为这些疾病均产生过量 TNF，而过量TNF又促进或加重这类疾病的发生。随着人们对TNF-R的基因结构、染色体定位 、表达调控等深入研究，sTNF-R的应用有希望为SLE的治疗开辟一个新的途径。

　　从以上观察中可得出结论，TNF-α、sTNF-R参与SLE的免疫病理损伤过程，SLE患者血中sT NF-R水平增高可作为病情活动的指标之一。TNF-α/sTNF-R比值对于判定SLE病情活动、 预后及监测治疗有重要参考价值。

　　参 考 文 献

　　1,高俐，王维忠.肿瘤坏死因子受体研究进展.白求恩医科大学学报，1998，24： 108-110.

　　2,陈淳媛，杨作成，连乃文.肿瘤坏死因子系统的免疫网络机制及其在风湿热中的 作用.国外医学免疫学分册，1998，21：255.

　　3,Diez-Kuiz A,Tilz GP,Zangerle R,et al.Soluble receptors for tumor necr osis factor in clinical laboratory diagnosis.Eur J Haematol,1995,54:1-8.

　　4,Erickson S,Sanvage F,Kikly K,et al.Decreased sensitivity to tumor necr osis factor but normal T-cell development in TNF receptor-2-deficient mice.Na ture,1994,372:560.

　　5,Aderka D,Wysenbeek A,Engelmann H,et al.Correlation between serum level s of soluble tumor necrosis factor receptor and disease activity in systemic lup us erythematosus. Arthritis Rheum,1993,36:1111-1120.

　　6,Girardin E,Roux-Lombard P,Grau GE,et al.Imbalance between tumor necro sis factor-alpha and soluble TNF receptor concentration in severe meningococcae mia.Immunology,1992,76:20-23.

　　7,Moreland L,Margolies G,Lows W,et al.Recombinant soluble tumor necrosis factor receptor fusion protein:toxicity and dosefinding trial in refractory rhe umatoid arthritis.J Rheumatol,1996,23:11-13.

(收稿日期：1999-10-12)