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卵泡内精子显微注射治疗弱精子症
中华泌尿外科杂志
CHINESE JOURNAL OF UROLOGY
1999年第2期
434001湖北省荆州市第三人民医院泌尿外科 黄强 韩见知
同济医科大学同济医院泌尿外科 章咏裳
弱精子症是男性不育的常见原因，自然妊娠率低。Palermo等［1］首先报道的卵泡内精子显微注射（ICSI），是一种新发展起来的辅助授精技术，方法是将获得的精子直接注入卵泡内完成受精［1-3］。本技术精子无需发生顶体反应，明显提高了弱精子症的受精率和妊娠率，故可用于常规体外授精治疗后仍无正常受精或受精率低于5%、活力精子数目在5×105/ml以下，近端精路梗阻者［3］。李蓉等［4］采用ICSI授精技术治疗严重男性不育患者也获得成功。
一、促卵巢排卵
从治疗前一个月经周期的黄体期开始，每天经皮下注射1mg醋酸利普安使垂体处于脱敏状态。在月经的第1天开始卵巢被药物刺激，以促进卵泡发育，此时血清雌二醇水平低于0.22nmol/L，经阴道的超声波检查无卵泡生长，卵巢呈静止状态。在卵巢药物刺激的第1、2天，每天给予150IU的人绝经期促性腺激素（HMG）和150IU纯化的卵泡刺激素（FSH），在卵巢药物刺激的第3、4、5天，每天只给予150IU的HMG。从卵巢刺激的第6天开始，根据人体血清雌二醇水平和经阴道超声波检查图像决定HMG的注射量。当血清雌二醇≥2.94nmol/L，B超检查有两个或更多的直径在1.9cm以上的卵泡时,给予10 000IU HCG促使排卵。在HCG注射后，停止给予醋酸利普安和HMG［3］。
二、取卵及分离
(一)卵子的收集［5］
1.通过腹腔镜穿刺卵泡取卵。用腹腔镜检查卵巢状况后，插入特制的双腔针穿刺卵泡，以负压小于14kPa，吸出卵细胞及卵泡液，并即刻在显微镜下检查以确定吸出完整的卵子。必要时可进行第二次抽吸，抽吸出的卵子转移至培养液中。
2.B超引导下穿刺取卵。其途径有经腹部和经阴道二种。
(二)卵子的分离
穿刺吸取的卵母细胞浸于Earle平衡盐液中，4～6分钟后用缓冲液反复冲洗卵子，再用巴斯德吸管轻轻吸除清洗粘附着的放射冠［5］。
清洗后的卵母细胞在37℃、5%O2、5% CO2、90% N2的培养箱中孵育。4小时后开始观察卵母细胞，第一个极体出现后，即为处于中期的卵母细胞，可用于卵泡内精子显微注射。应用前，卵母细胞置于Dulbecco磷酸盐缓冲液或含0.1mol/L蔗糖的Earle平衡盐液中保存［5］。
三、精子的准备
(一)手法取精
禁房事3日以上，用手淫法采取精液标本，室温下液化，作精液常规检查。当精子数目小于1×105/ml时，诊断为弱精子症。将精液标本以600次/分的速度离心10分钟，取出离心沉淀的精液标本置于5ml体外受精培养基中，再以600次/分的速度离心5分钟，浓缩后的精液标本重新放置于体外受精培养基中，并在37℃和含5%CO2的培养箱中孵育。注射前再次离心［3］。
(二)附睾或睾丸获取精子
有精路梗阻［6］时可采用下列途径获取精子。
1.小切口附睾吸取精子（MESA）。选用静脉麻醉或局部浸润麻醉，在25～40倍手术显微镜下，于附睾头部作一纵形切口。于近端的附睾小管处，用塑管吸取无血细胞的附睾液体［7］。附睾头为精子的最佳储存地，此法常能达到获取精子的目的，但也存在一定的手术并发症，如感染、血肿、术后疼痛和术后附睾的纤维化等［7-9］。
2.经皮穿刺附睾抽吸精子（PESA）［8、9］。局部麻醉，配置一个20ml注射器和21G蝶形针头，抽吸前用拇指和食指固定睾丸，触及附睾，穿刺针刺入附睾头或附睾体，轻轻抽吸，标本液进入微吸管。当从附睾吸出的液体停止流动时，用一个闭合的动脉钳夹住微吸器，取下针头，将吸取液转移至含体外受精培养液的的falcon试管中。同法吸取对侧附睾内精子，以获取更多数量的精子。PESA的成功与附睾扩张程度有关，而且多个附睾穿刺点有助于PESA的成功。PESA较MESA简单、有效，并发症亦较少［6］。
3.从睾丸组织碎块中分离精子。在MESA和PESA采集的精液标本无法满足卵泡内显微注射时,可切取睾丸组织碎块，从中分离出精子。采用局部浸润麻醉，经阴囊切口切除0.5g的睾丸组织。置于佩特里细菌培养皿中（内含3μl Earle培养液）。解剖睾丸组织，使精子从睾丸组织中分离出来，并放置于含25%血清蛋白的3μl Earle培养液中，使精子进一步发育成熟［10，11］。
四、显微注射及判断受精
行卵泡内精子显微注射的器械，包括两个带吸管头的毛细玻璃管，分别作为固定管和注射管。固定管的内外径分别为20μm和100μm。注射管的内外径分别为5μm和7μm，其前端有一
50°斜角的尖锋，可以帮助毛细玻璃管穿越透明带。显微注射在附有加热台的400×显微镜下进
行［3］。
卵泡内精子显微注射的操作在佩特里细菌培养皿中完成。佩特里细菌培养皿中间为3～4μl聚烯吡酮中央小滴，内中含有培养好的精子。围绕中央小滴放射状放置8滴体外受精培养液，每滴约为3～4μl，每滴培养液中含有一个卵母细胞。这些小滴由约3ml石蜡油均匀覆盖［2］。
在400×显微镜下，将注射管插入中央小滴，选择一个形态正常、具有活力的精子，通过注射管反复吸取和排放中央小滴内的液体，使精子“眩晕”而使精子固定，并由精子尾部将“眩晕”的精子吸入注射管的顶端。然后将注射针转入含有卵细胞的悬滴中。通过固定管和注射管的调节，卵母细胞转动后使第一极体定向于6点或12点位。卵母细胞由固定管加负压轻轻吸住，使之固定于该管的前端。将注射管的尖锋由3点位刺入卵母细胞的透明带和卵膜，进入卵质注入精子。完成注射精子后，轻轻退出注射管，固定管释放卵母细胞。重复上述步骤直至完成所有卵母细胞的显微注射授精［2，3］。进行显微注射操作时，应保持精确协调的动作，否则可能损伤精子和卵子而导致受精失败［1］。
将显微注射后的卵母细胞放置于20μl体外受精培养基微滴中孵育, 18小时后开始观测卵母细胞的变化。当卵母细胞中出现两个原核，并有第二极体出现，说明受精成功［2，3］。
五、胚胎移植
显微注射24小时后开始观察胚胎分裂，如含有完整对称的裂球，无细胞外碎片为发育良好的胚胎。在注射后48小时，将三个发育良好的胚胎装入15～20μl含Earle培养液和75%血清液中，经阴道放置于子宫腔内，其余发育良好的胚胎进行冷保存［1，10］。
胚胎移植后的14、21、28天，检测血清HCG。当血清HCG呈进行性升高时,则可以认为出现妊娠。7周后经阴道超声波检查观察到妊娠囊和胎儿心跳，则确定为临床妊娠［1-3］。
六、讨论
Salom等［3］报告1994～1995年对58对不育夫妇进行了67次卵泡内精子显微注射治疗。丈夫的平均年龄为35.1岁, 精子数小于1×105/ml，不育期平均6.1年。在67次治疗中，共获取877个冠丘细胞，其中660个处于中期的卵母细胞进行了注射，588个卵母细胞在显微注射后继续分裂，注射后18小时进行检测，有386个卵母细胞出现了两个清楚的原核，受精率平均66.4%，352个胚胎出现正常卵裂现象（卵裂率平均90.9%），256个胚胎发育良好，在64次受精卵移植中共移植子宫腔内237个胚胎。共有18例临床妊娠，妊娠率平均28.1%。4例在头3个月出现流产。5例已足月分娩，共有8个新生儿产出（包括3个单胞胎、1个双胞胎、1个三胞胎）。9例妊娠仍在继续，15周时检测血清β-HCG和α-甲胎蛋白水平正常，16周时经羊膜穿刺检测染色体组型正常，20周时常规产前检查显示胎儿发育正常。
Palermo[1]报道的卵泡内精子显微注射后的受精率为66%，临床妊娠率为22%。李蓉等[4]应用卵泡内精子显微注射治疗严重少、弱、畸精症31例，受精率为62%，临床妊娠率为26%（8/31）。这些结果同精子质量正常的体外授精结果无明显差异［12］。Salom等［3］报道的流产率也并不比常规体外授精机率高［12］。
由于卵泡内精子显微注射技术没有自然受孕过程中许多精子必经的过程，如精子运动、顶体反应、透明带的穿透、配子间膜的融合，故其对精子数目、能动度、畸形率的要求大大降低[3]。即使在一些精子质量完全不能满足注射的病例，由于取精方法的改善，如小切口附睾吸取精子、经皮附睾穿刺吸取精子和睾丸组织碎块分离精子，也能完成受精。但显微操作是卵泡内精子显微注射技术成功的关键，显微操作技术能否精确掌握将影响治疗效果［1］。随着精子来源的改进，显微操作技术的完善，卵泡内精子显微注射这一新技术在治疗弱精子症中的作用将更显著。但是仍应严格掌握适应证以免增加潜在遗传性疾病发生的危险［13］。
《参考文献》
[1] Palermo G, Joris H, Devroey P,et al.Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon
into an oocyte. Lancet, 1992，340∶17-18.
[2] Tsirigotis M, Yang D, Redgment C, et al.Assisted fertilization with intracytoplasmic sperm injection.
Fertil Steril, 1994，62∶781-785.
[3] Salom M,Minguez Y,Rubio C,et al.Intracytoplasmic sperm injection:a treatment for extreme
oligospermia. J Urol,1996，156∶1001-1004.
[4] 李蓉, 庄广伦, 张敏芳. 卵母细胞单精子显微注射治疗男性因素及不明原因不育.中华妇产科
杂志，1997，32∶211-213.
[5] Fishel S,Timson J,Lisi F,et al.Evalution of 225 patients undergoing subzonal insemination for the
procurement of fertilization invitro.Fertil Steril, 1992，57∶840-849.
[6] Rosenlund B, Sjoblom P, Dimitra Kopoulos A,et al.Epididymal and testicular sperm for intracytoplasmic
sperm injection in the treatment of obstructive azoospermia. Acta Obstet Gynecol Scand,1997，76∶
135-139.
[7] Girardi S,Schlegel P.Microsurgical epididymalsperm aspiration:review of techniques,preoperative
considerations and results.J Androl,1996，17∶5-9.
[8] Collins G, Critchlow J, Lau M,et al.Open versus closed epididymal sperm retrieval in men with
secondarily obstructed vasal systems — a preliminary report. J Urol,1996，78∶437-439.
[9] Tsirigotis M,Pelekanos M,Yazdani N,et al.Simplified sperm retrieval and intracytoplasmic sperm
injection in patients with azoospermia.Br J Urol, 1995，76∶765-768.
[10] Michael A,Elsner C,Kort H,et al. A live birth from intracytoplasmic injection of a spermatozoon
retrieved from testicular parenchyma.J Urol, 1995，154∶1136-1137.
[11] Silber S,Steirteghem V,Lin J,et al.High fertilization and pregnancy rate after intracytoplasmic sperm
injection with spermatozoa obtained from testicle biopsy. Hum Repord,1995，10∶148-152.
[12] Bustillo M,Zarutskie P.Assisted reproductive technology in the United States and Canada:1994 results
generated from the American Society for Reproductive Medicine/Society for Assisted Reproductive
Technology Registry.Fertil Steril,1996，66∶697-705.
[13] Vogt P.Genetic aspects of artificial fertilization. Hum Repord,1995，10∶(Suppl 1)128-137.
(收稿：1998-04-21)
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