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深Ⅱ°烫伤早期大鼠空肠P物质阳性神经与血管通透性的相关性变化
第四军医大学学报1999年第20卷第5期
陶克 陈璧 李志远 胡大海 王波涛
摘 要 目的：研究深Ⅱ°烫伤后早期大鼠空肠P物质(SP)阳性神经变化与血管通透性变化，探讨其相关性.方法：运用免疫组化技术和改良伊文思蓝渗出法，分别观察和检测大鼠空肠SP阳性神经变化和血管通透性变化.结果：烫伤后1 h大鼠空肠SP阳性神经密度达到最高值，后明显下降，烫伤后4 h～8 h 达到最低值，随后逐渐恢复；烫伤后1 h大鼠空肠血管通透性最高，后缓慢下降，烫伤后8 h～24 h 达到最低值，而后略有升高，烫伤后72 h 接近正常值.深Ⅱ° 烫伤后早期大鼠空肠SP阳性神经变化与血管通透性变化明显相关.结论：P物质是引起烫伤后早期血管通透性升高的重要介质之一.
关键词:P物质 空肠 免疫组化 伊文思蓝 烧伤
0 引言
P物质(SP)作为神经肽中速激肽类主要成分之一,其生理功能除了作为神经递质调节痛觉传导及神经内分泌过程,影响呼吸系统及胃肠道功能外,心血管效应也很显著［1］.我们观察了深Ⅱ° 烫伤后早期72 h内大鼠空肠SP阳性神经变化和血管通透性变化，以进一步明确SP对烫伤后早期血管通透性升高的作用.
1 材料和方法
1.1 动物及分组、大鼠深Ⅱ° 烫伤模型制作 雄性SD大鼠56只（本校实验动物研究中心提供），体重160 g～180 g.随机分为免疫组化组和改良伊文思蓝组，分别于烫伤后1，4，8，24，48，72 h用于实验（每个时相点4只动物），另外8只为对照组.麻醉用戊巴比妥钠腹腔注射（30 mg/kg）. 烫伤前1 d大鼠背部区域用80 g/L Na2S脱毛，用恒温恒压电烫仪烫头（温度80℃，压力2.0 kPa）与皮肤接触8 s，致TBSA 20%深Ⅱ° 烫伤.烫伤深度病理证实. 伤后动物单笼喂养，创面不予处理.
1.2 免疫组化染色 在每个时相点，动物深麻醉状态下，开胸并经左心室灌注300 mL生理盐水，随后立即用40 g/L多聚甲醛400 mL（pH7.4）灌注固定1 h，而后立即开腹于小肠中下1/3处切取空肠5 mm一段，浸入40 g/L多聚甲醛于4℃冰箱后固定24 h，再移入20 g/L蔗糖中4℃条件下脱水24 h.最后取横断面用冰冻切片机作40 μm厚冰冻切片，移入漂染盒中.
ABC 免疫组化反应程序：参照Hsu等［2］报道的程序进行.
来自每只大鼠的10 张切片用10 g/L铬矾明胶粘贴于同一张载玻片上，风干后常规脱水透明，封片，镜下观察.参照Dhital等［3］对脑血管周围神经纤维密度半定量的方法，对肠绒毛内SP-IR阳性神经纤维的分布密度行半定量测定.在OlympusBH-2型显微镜目镜筒内装入C6型网格计数尺，对每只大鼠计数5张切片，每张切片在同一放大倍数下（×400）随机取20个视野计数神经纤维与网格线交叉点数，计算每个计数尺面积内交叉点数均值.空肠绒毛中SP阳性神经纤维分布密度以正常对照的百分数表示.
1.3 改良伊文思蓝渗出法 参照Lu等［4］的方法进行.先用分光光度计（Beckman公司）测出波长为620 nm下伊文思蓝含量为（0.005～50）mg/L（二甲酰胺稀释）的光吸收度，绘出标准曲线.在每个时相点前30 min从动物尾静脉注射伊文思蓝2 mg/kg(Serva公司)，而后按时相点开胸并经左心室灌注300 mL生理盐水，冲出循环系中血液及残存伊文思蓝.立即开腹于小肠中下1/3处切取空肠1 cm两段，称重后随即置于2 mL二甲酰胺中，50℃ 恒温水浴箱中水浴24 h，将提取液用分光光度计测出620 nm下的光吸收度，从标准曲线上得出相应的伊文思蓝含量，再计算量与重量比值，作为空肠所含伊文思蓝量（μg/g）.空肠血管通透性变化以空肠所含伊文思蓝量占正常对照的百分数表示.
实验数据均用SPSS统计软件处理，各组均以均数±标准差（X±s）表示，做t检验比较差异的显著程度.
2 结果
2.1 空肠绒毛中SP阳性神经形态学变化 正常对照组大鼠空肠绒毛内可见丰富的SP阳性神经纤维，大多沿绒毛纵轴走行，较粗大的主干间有细的分支结构相连.纤维大多有膨体，末端延伸到粘膜上皮细胞基底部位（Fig 1）.伤后1 h组SP阳性神经纤维呈现较强的染色反应，粗纤维增多，膨体多见（Fig2）. 伤后4 h组可见染色反应已有所减弱，但仍较正常对照组强，粗细纤维比例大体相同，膨体仍多见，分支、交叉仍明显（Fig3）. 伤后8 h组及伤后24 h组染色反应已明显减弱，纤维数量减少，并呈断续样走行，膨体减少，分支、交叉已少见（Fig4）. 伤后48 h组（Fig 5）及伤后72 h组（Fig 6）染色反应同正常对照组相比又有所增强，以伤后48 h组较明显，分支及交叉较伤后24 h组有所增多，至伤后72 h组时空肠绒毛内SP阳性神经纤维已基本接近于正常对照组.免疫组化对照试验：均为阴性结果.
2.2 空肠绒毛中SP阳性神经纤维分布密度的变化 总计数结果来看，与正常对照组相比变化趋势为伤后先出现明显的神经纤维分布密度升高，而后降低及再略升高的变化.伤后1 h组明显升高，为对照组的2.13倍（P＜0.01）. 伤后4 h组为对照组的1.67倍（P＜0.01）.伤后8 h组及伤后24 h组下降，分别为对照组的80.5%，91.2%（P＜0.01）.伤后48 h组又有所升高，为对照组的1.20倍（P＜0.01）. 至伤后72 h组时，与正常对照组相比相差不显著（Fig 7）.
2.3 空肠血管通透性的变化 总的变化趋势为烫伤后空肠血管通透性迅速增加，而后缓慢下降和再增加的变化（EBμg/g，X±s，n=8）.伤后1 h组明显增加，为对照组的4.37倍（P＜0.01）. 伤后4h组为对照组的2.74倍（P＜0.01）.伤后8h组及伤后24h组下降，分别为对照组的1.59，1.16倍（P＜0.01）.伤后48 h组又有所升高，为对照组的2.42倍（P＜0.01）. 至伤后72 h组时，与正常对照组相比相差不显著（Fig 8）. 对空肠绒毛中SP阳性神经纤维分布密度和空肠血管通透性数据进行相关性分析，两者在P=0.01水平上明显相关.
3 讨论
SP作为发现最早的，也是目前研究最为清楚的神经肽中具有11个氨基酸的速激肽类之一，不仅广泛分布于中枢神经系统的许多区域,在外周神经系统的神经纤维中，即SP阳性神经纤维中,特别是感觉神经纤维如脊髓侧角、视神经、三叉神经及听神经等［5］.此外，还分布于整个胃肠道中. Hokfelt等［6］报道此处的神经细胞中有10%～20%为SP神经细胞.含SP阳性神经纤维围绕神经细胞交织成网并伸向肠粘膜、肠血管，然后再连接初级感觉神经细胞的周围支. sP的生理功能十分广泛：作为神经递质调节痛觉传导;参与神经内分泌过程;心血管效应,可引起血压升高,心率加快及交感传出活动增强,对心脏冠状动脉及多数外周血管有较强的扩张作用;影响胃肠道功能:使肠道收缩,促进小肠水和电解质分泌. 近年来,SP作为介导炎症等引起的血管扩张和通透性增加的介质的作用也引起重视.临床上烧伤后早期血管通透性增加,除热力直接损伤血管结构外,一些化学递质如血管活性胺(组胺,5-羟色胺)、前列腺素(PG)、氧自由基等是介导此过程的重要因子,本实验为证明SP参与此过程提供进一步依据.
从烫伤（深Ⅱ° 20% TBSA）后大鼠空肠绒毛内SP阳性神经纤维的形态学及分布密度变化来看,与胡大海等［7］在严重烫伤大鼠（Ⅲ°30% TBSA）发现的规律基本一致. 烫伤后早期（8 h以前）由于应激作用肠道内SP合成大大增加，表现为SP阳性神经纤维分布密度增加，染色增强，含丰富SP的膨体增加，而肠绒毛内SP阳性神经末梢是SP应激性释放的重要部位，这些SP阳性神经末梢与粘膜上皮和血管接触密切，因此可以推测绒毛内SP阳性神经参与了绒毛内粘膜上皮和血管的病理改变. sP阳性神经随后(8 h组～24 h组)分布密度下降，染色变浅，膨体减少，部分有断续现象，提示SP已经大量地消耗性释放，绒毛内SP阳性神经所含SP量已有所减少，而后(24 h组～48 h组)绒毛内SP阳性神经分布密度有所增加，染色又有所增强，膨体增多，分支及交叉多见，说明：空肠绒毛内SP阳性神经纤维由其来源的神经元胞体向末梢合成及运输SP过程增强，或者可能是由于末梢组织损伤加重而出现SP蓄积现象.至72 h组时，SP阳性神经从形态及分布密度来看已接近于正常对照组，提示经过体内复杂机制的调节，空肠绒毛内SP阳性神经纤维已基本恢复.
     
图 1 正常对照组，SP阳性神经纤维沿绒毛呈网状纵向走行，有分支(↑)与膨体(↑)
fig 1 In control the retiform and fore-and-aft SP-IR nerves along the villuses with offshoots and intumescent bodies ×400图 2 烫伤后1 h，染色增强，粗纤维增多，膨体(↑)多见
fig 2 The staining of SP-IR nerves increased and more crassitude nerves and intumescent bodies 1 h after burns ×400图 3 烫伤后4 h，染色开始减弱，仍有明显分支(↑)与膨体(↑)，神经开始出现断续样走行( )
fig 3 The staining of SP-IR nerves began to decrease with obvious offshoots and intumescent bodies 4 h after burns ×400图 4 烫伤后24 h，染色略有增强，阳性神经纤维及其分支(↑)和膨体(↑)稍增多
fig 4 The staining of SP-IR nerves and the number of SP-IR nerves, offshoots and intumescent bodies slightly increased 24 h after burns ×400图 5 烫伤后48 h，染色增强，神经分支(↑)和膨体(↑)又有所增多
fig 5 The staining of SP-IR nerves and the number of SP-IR nerves， offshoots and intumescent bodies obviously increased 48 h after burns ×400图 6 烫伤后72 h，SP阳性神经纤维在数量及形态上已接近于正常对照组
fig 6 The shapes and the number of SP-IR nerves were approximately the same as those of the controls 72 h after burns ×400
图 7 20% TBSA深Ⅱ° 烫后72 h空肠绒毛中SP阳性神经纤维分布密度的变化
fig 7 Distributed density of SP-containing nerve fibers in jejuna of burned rats during the first 72 hours after deep partial_thickness skin burns(20%TBSA)
bP＜0.01 vs control.
图8 20% TBSA深Ⅱ° 烫伤后72 h空肠血管通透性的变化
fig 8 Changes of vascular permeability in the jejuna of burned rats during the first 72 hours after deep partial-thickness skin burns(20%TBSA)
bP＜0.01 vs control.
烧伤后一个重要的病理变化是微血管的通透性升高，导致水肿和休克.研究表明SP是一种初级感觉神经细胞的递质，SP阳性神经的功能不仅包括传入功能，还包括传出功能［8］.我们可以推测：烫伤发生后，局部的伤害性刺激信号迅速沿局部SP阳性神经传入中枢，同时神经外周端释放SP，从中枢传出的信号也迅速沿全身的SP阳性神经传递至神经末梢，促进SP的释放，参与组织中的血管扩张和通透性升高.因此烫伤后早期（1 h），空肠血管通透性迅速增加，随后由于大量SP的消耗性释放及失活，空肠绒毛中SP阳性神经分布密度逐渐下降，其外周端释放 sP也有所减少，但仍有较正常多的SP作用于空肠血管，使血管通透性仍高于正常对照组.而后随着SP阳性神经分布密度有所增加，空肠血管通透性也随之增加.至烫伤后72 h，与空肠绒毛内SP阳性神经纤维的基本恢复相一致，空肠血管通透性也接近正常对照组.本实验结果表明，空肠绒毛中SP阳性神经纤维分布密度变化和空肠血管通透性变化的趋势基本相同，具有明显的正相关性，为进一步证明SP参与严重烫伤后组织中的血管通透性升高提供了依据.
基金项目：全军九五重点资助项目 No.96L043
作者简介：陶 克，男，1974-07-02生，江苏启东人，汉族.1997年第四军医大学毕业，1997年烧伤外科硕士生. 导师陈 璧. tel：（029）3375298 Fax：（029）3251734 E-mail burns@pub.xaonline.com
作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心烧伤外科，陕西西安 710033
参考文献
1 韩济生，关新明主编. 医用神经生物学.武汉：武汉出版社，1996：223-224
2 Hsu SM, Raine L, FangerH. Use of avidin-biotin-peroxidase complex(ABC)in immunoperoxidase technigues: a comparison between ABC and unlabeled antibody(PAP) procedures. J Histochem Cytochem,1981;29（6）:577-580
3 Dhital KK, Gerli J, Lincoln P et al. Increased density of perivascular nerves to the major cerebral vessels of the spontaneously hypertensive rat: differential changes in noradrenaline and neuropeptide Y during development. brain Res, 1988;444（1）:33-45
4 Lu W, Chen YL, Xia ZF et al. Modified Evans blue fluorimetry for determination of pulmonary vascular permeability in rats sustaining burns, and delayed fluid resuscitation of burn shock. Burns, 1997; 23(6):490-492
5 Pernow B. Substance P. Pharmacol Rev, 1983;35(1):85-141
6 Hokfelt T, Elfvin LG, Schultberg M et al. On the occurrence of substance p-containing fibers in sympathetic ganglia: Immunohistochemical evidence. Brain res,1977;132(1):29-41
7 Hu DH, Chen B, Lin S et al. Changes in Substance P in the jejuna of rats after burns. Burns， 1996;22(6):463-464
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