|
珊瑚修复骨缺损中转化生长因子β的观察
第二军医大学学报1999年第20卷第6期
苗林 刘宝林
摘 要 目的：观察转化生长因子β(TGFβ)在珊瑚人工骨修复骨缺损中的分布及作用。方法：家兔72只，颅骨造成1.5cm直径圆形缺损,分别植入珊瑚、羟基磷灰石(HA),另设空白对照，于术后2，4，8，12周取材，组织学处理，选取石蜡切片作ABC免疫组化染色，观察TGFβ分布并作图像定量分析。结果：成骨细胞、新生成之骨细胞呈阳性反应，细胞间质及纤维组织中散在阳性颗粒，珊瑚组、HA组远离原骨床区阳性程度明显高于空白对照组。结论：珊瑚人工骨可刺激、引导TGFβ在局部聚集，促进骨修复。
关键词：珊瑚 转化生长因子β 骨修复
珊瑚人工骨具有良好的生物相容性和骨传导作用，且具有生物降解的特性［1,2］,但其本身并无骨诱导性,相对降解速度较快,对较大骨缺损的修复尚难如人意。因此,将其与各种骨生长因子复合应用以增强骨修复能力是今后人工骨研究的方向之一。转化生长因子β(TGFβ)是一种重要的骨生长因子，对骨的生成改建起重要的调节作用。本研究旨在通过免疫组化的方法观察TGFβ在珊瑚人工骨修复骨缺损中的表达，了解珊瑚人工骨在骨修复区对TGFβ聚集的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 珊瑚采自海南三亚浅水滨珊瑚，加工成20～40目大小颗粒状，颗粒内有微孔，清洗后，干燥，60Co照射消毒，剂量大于104Gy。羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）为四川成都新津县龙马化工厂生产，致密颗粒状，粒度20～40目。
1.2 实验动物及分组 选用家兔72只，第四军医大学动物中心提供，体质量2.0～2.4kg，雌雄兼有，随机分为珊瑚植入组、HA植入组和空白对照组3组。共4个时间点，每组各时间点均6只动物。
1.3 手术步骤 按文献［2］方法进行，造成颅骨1.5cm直径圆形缺损，分别植入珊瑚或HA，对照组无植入物。
1.4 取材与标本处理 分别于术后2，4，8，12周处死各组动物。用金刚砂片切割，取下缺损区及周围骨质、骨膜，10%甲醛固定后常规石蜡切片。
1.5 免疫组织化学分析 选取珊瑚组、HA组及空白对照组术后2，4，8，12周标本，石蜡切片经二甲苯脱蜡,采用ABC法进行免疫组化染色,PBS液代替一抗作阴性对照。抗TGFβ单克隆抗体由上海细胞生物研究所生产，ABC免疫试剂盒为Vector Lab公司产品。
免疫组化染色切片在Quantimet 570图像分析仪(Leica公司)上作灰度定量分析,将定量分析分2个区域测定,即靠近原骨床区和远离原骨床区(以下简称近、远区)。每一标本测2张切片,每张切片近、远区各选4个视野测定,取均值,所得数据用第四军医大学统计教研室研制的SPLM统计软件进行t检验和方差分析。
2 结 果
2.1 光镜观察 植入后2～4周，珊瑚组及HA组，可见大量纤维组织长入陶瓷颗粒间及孔隙内,原骨床边缘新骨形成,不断向缺损中心区长入。在近原骨床区成骨细胞数量多，骨化活跃，骨细胞中有大量阳性颗粒，间质中可以看到弥散的阳性颗粒，远区阳性反应稍有减弱，新生骨细胞内呈阳性反应，近骨膜侧的成纤维细胞呈阳性反应。珊瑚组植入材料间增生的纤维结缔组织呈阳性或弱阳性反应；HA组与珊瑚组类似,材料间的纤维组织阳性范围较为局限(图1A,B)；空白对照组新骨形成不明显，成骨细胞数量少，成骨细胞可见阳性反应，近原骨床区间质中可见弥散的阳性颗粒，向缺损中心区减弱(图1C)。
  
图1 术后2周 各组TGFβ表达免疫组化染色(ABC×132)
Fig 1 Expression of TGFβ by immunohistochemistry staining
2 weeks postoperatio n (ABC×132)
A：Coral group；B: HA group；C: Control group
植入后8周，珊瑚组和HA组新骨生成量均显著增加，成骨细胞呈阳性着色，植入陶瓷周围也可见到阳性着色，珊瑚被逐渐吸收，HA占位无明显变化；空白对照组近原骨床侧有少量新骨长入缺损区，缺损区大部分仍为纤维结缔组织充填，阳性反应主要局限于近骨床端新骨及邻近间质中。
植入后12周，珊瑚组与HA组新骨形成均达缺损中心区，新骨已改建，阳性反应主要局限于新骨边缘的成骨细胞，阳性反应程度稍有下降，珊瑚已被完全吸收，HA占位无明显变化；空白对照组新骨长入不多，阳性反应主要局限于新骨边缘,近骨膜侧软组织中可见较多成纤维细胞呈阳性。
2.2 图像分析 结果见表1。无论是珊瑚组还是HA组，各期内近、远区相比较，相差不显著(HA组2周时除外)，而空白对照组近、远区之间相差显著，近区阳性程度明显高于远区。从各时间点，各组间比较来看，近原骨床区各组之间相差小，而在远原骨床区珊瑚组、HA组与空白对照组相差显著。
3 讨 论
TGFβ是一族氨基酸序列高度保守并具有广泛生物学活性的蛋白多肽,对骨修复、改建有突出作用。骨组织中含有大量的TGFβ，成骨细胞不仅具有高亲和力的TGFβ受体，以接受TGFβ的刺激而增殖，产生大量的基质，而且成骨细胞本身也能合成和分泌TGFβ。TGFβ能刺激基质蛋白合成，抑制破骨细胞前体（osteoclast precursors）形成和骨吸收［3］。
表1 TGFβ免疫组化染色图像分析数据
Tab 1 The data of histomorphometry of immunohistochemical staining of TGFβ (n=6， ±s)
| Group |
Region |
Time after implantation(t/week) |
| 2 |
4 |
8 |
12 |
| Control |
M |
111.3±6.3△△ |
118.1±5.0△ |
122.5±2.3△ |
124.4±2.9△ |
| |
D |
127.4±3.7 |
125.5±4.8 |
128.8±2.7 |
131.0±1.4 |
| Hydroxyapatite |
M |
121.4±4.8 |
116.0±7.6 |
120.4±7.3 |
120.8±5.5 |
| |
D |
112.4±3.8* |
115.2±5.7** |
119.9±4.8* |
122.5±3.6** |
| Coral |
M |
114.8±8.4 |
120.0±3.9 |
119.5±2.6 |
124.7±2.6 |
| |
D |
116.6±7.1* |
115.3±3.1** |
120.0±3.6* |
123.4±1.7** |
M: Medial to original bone bed；D: Distal to original bone bed
*P＜0.05, **P＜0.01 vs control group; △P＜0. 05 , △△P＜0.01 vs distal to original bone bed 研究表明，TGFβ的促进骨修复作用是和其他骨生长因子一起协同作用［4，5］。TGFβ主要作用是刺激间充质细胞大量增殖，增殖的间充质细胞在其他骨生长因子如骨形成蛋白(BMP)及成纤维细胞生长因子(FGF)等的作用下,分化并表达骨细胞、成骨细胞及成纤维细胞的表型，当骨生成细胞增殖达一定程度后，TGFβ则刺激这些细胞产生各种细胞外基质，并抑制基质的降解，同时调节其钙化。
本研究结果显示，TGFβ阳性着色主要在成骨细胞、新生成之骨细胞胞质内，在细胞间质中也可看到弥散的阳性颗粒，在陶瓷周围纤维结缔组织中也可见到弥散的阳性颗粒。图像分析结果也提示，由于近原骨床区骨化活跃，有原骨床中释放之TGFβ作用参与骨修复，表现为近原骨床区3组间无明显差别；远离原骨床区，空白对照组这种阳性反应变弱，而珊瑚和HA组，由于陶瓷的刺激、引导作用，造成局部TGFβ的聚集，骨生长活跃，使远区的阳性程度明显高于空白对照组，这可能是生物活性陶瓷用于骨缺损修复的作用之所在。研究结果提示TGFβ在骨修复中起着重要作用。
作者简介：苗 林，男，1963年1月生，博士，主治医师
作者单位 苗 林 第二军医大学长征医院口腔科，上海，200003；
刘宝林 第四军医大学口腔医院
参考文献
1 苗 林,刘宝林.珊瑚人工骨皮下肌肉种植的组织学观察.实用口腔医学杂志，1995，11(2):86
2 苗 林,刘宝林.珊瑚人工骨修复兔颅骨缺损的骨形态测量学研究.中国修复重建外科杂志，1997，11(3):1323 Bonewald LF, Mundy GR. Role of transforming growth factorbeta in bone remod eling. Clin Orthop，1990，(250):261
4 侯 军,周树夏,刘宝林，等.β转化生长因子在火器伤下颌骨缺损早期修复中的应用.实用口腔医学杂志，1993，9(2):115
5 朱 力,周树夏,杨连甲.β转化生长因子体内介导骨膜成骨过程中骨形成蛋白的分布及意义.实用口腔医学杂志，1996，12(1):19
|
