|
阴茎勃起功能障碍的基因治疗
中华泌尿外科杂志CHINESE JOURNAL OF UROLOGY
1999年第20卷第10期No.10Vol.20 1999
张新华 胡礼泉
关键词：阳萎 基因治疗
近20年来，人们对于阳萎的病理生理学、诊断及治疗水平的认识有了很大进步，如阴茎中一氧化氮（NO）及其合酶（NOS）的发现［1］、海绵体内注射（ICI）、负压装置和阴茎假体的改良、尿道前列地尔（alprostadil）栓剂［2］的应用等。特别是最近开发的口服药昔多芬（sildnafil，viagra）已成为男科医生治疗阳萎的有效药物［3］。但是目前所有的治疗方法都有一定的局限性或副作用。因此应用分子生物学技术进一步深入研究阴茎勃起的病理生理学，以探讨阳萎基因治疗的方法和途径很有必要。
近来分子生物学Northern，Western和Southern blotting印迹技术及多聚酶链反应（PCR），使目的基因及基因产物能够被识别、分离、测系、合成、克隆及体外表达，从而准确地推测出单个基因在细胞内所起的作用。虽然阳萎是否存在遗传学缺陷缺乏足够证据，但这并不妨碍基因治疗应用于勃起功能障碍的探索。勃起功能障碍是由于阴茎海绵体平滑肌细胞收缩舒张的平衡关系被破坏的结果，因此，恢复这种精细平衡关系的基因水平的治疗均可望用来治疗阳萎。
一、阳萎基因治疗的目的基因及载体
目的基因异常是疾病发生的根源，该基因遗传分子结构清楚，基因已被克隆，其一级结构和表达调控机制较为清楚［4］。阳萎通常被认为是阴茎神经末梢或内皮细胞NO合成下降所致，或是受NO诱导发生舒张反应的海绵体平滑肌顺应性受损的结果［5］。因此，NO是介导阴茎勃起的主要神经递质［6］，由NOS催化L-精氨酸而生成。NOS主要有内皮细胞型NOS（eNOS）、神经细胞型NOS（nNOS）及诱生型NOS（iNOS）三种同功酶。依此，NOS基因可作为阳萎治疗的目的基因。
Magee等［7］通过RT-PCR鉴定出大鼠阴茎中存在一种新型的nNOS，称为PnNOS。阴茎中仅存在这种类型的nNOS，并且已从大鼠阴茎cDNA文库中克隆出PnNOS的全部编码区。测系后表明它与小脑nNOS（CnNOS）的主要差别是它存在一个34个氨基酸的系列，这可能是这种新型NOS的功能区。PnNOS活性与几种类型的阳萎有关，因此可作为一个十分有用的目的基因。
Garban等［8］克隆出大鼠和人阴茎iNOScDNA，测系大鼠阴茎iNOS cDNA并且与其血管iNOS进行同源性比较，发现两者有13个核苷酸及6个氨基酸存在差异，而与两条参考系列同时存在差异的氨基酸残基只有两个（270位点及591位点的氨基酸残基），均位于酶活化区的上游。而人iNOS cDNA片段是通过RT-PCR获得，测系后与人肝细胞iNOS进行同源性比较，发现其编码区有8个碱基改变，导致6个氨基酸与肝细胞iNOS不同。这些改变集中在黄素腺嘌呤单核苷酸（FAD）与NADPH结合位点之间，钙调蛋白位点之前。无论HPiNOS还是RPiNOS，氨基酸的差异均存在于酶活化位点之外。由于iNOS的器官特异性，因此iNOS基因也是阳萎基因治疗的理想目的基因。
除NOS外，K+通道，血管紧张素转化酶基因（ACE）插入/缺失（ID）的多态性［9］等遗传学因素也与阳萎的发病有关，也可选择作为目的基因。
用于阳萎基因治疗的载体包括质粒DNA载体和病毒载体。裸DNA质粒的转染效率很低，因此人们试图用脂质体包装裸DNA，这一措施使转染效率增加了5 000倍，而且没有免疫原性［10］。但是由于肝脏的吸收，静脉内应用脂质体基因复合体很快被清除，因此其转染效率仍不高。病毒载体主要有逆转录病毒载体及腺病毒载体，转染效率高，但是反复应用时，可使宿主产生免疫反应，甚至损伤宿主细胞，包括激活癌基因，产生严重后果［11］。
二、阳萎基因治疗的实验研究
许多学者已经开始进行阳萎基因治疗的动物实验研究。Garban等［8］用两种方法对年龄相关的大鼠阳萎模型进行基因治疗，一种方法是在基因水平诱导生成内源性iNOS。他们在老年大鼠（20月龄）和高龄大鼠（30月龄）皮下包埋渗透性泵，泵内含有iNOS诱导剂，包括LPS，鼠类 INF，人类TNFα及人类IL-1 β，泵以导管与阴茎海绵体相连。以成年大鼠（5月龄）或未治疗的大鼠（20月龄或30月龄）作为对照，治疗3～6天后，测量电刺激（EFS）海绵体神经诱发的勃起反应，同对照组相比，老年大鼠和高龄大鼠勃起障碍改善，且Western印迹法，NADPH硫辛酰胺脱氢酶及NOS活性测定法均表明这些大鼠阴茎中有iNOS诱导生成。另一方法是从大鼠阴茎平滑肌细胞（RPSMC）诱生的iNOS mRNA克隆出iNOS cDNA，然后以脂质体作载体，将PcDNA 3-RPiNOS注射入实验组大鼠阴茎海绵体中，用外源性补充RPiNOS cDNA进行基因治疗。治疗10天后，EFS反应表明大鼠年龄相关的阳萎亦被改善。PCR可检测出阴茎中有iNOS结构存在，RT-PCR及Westem印迹法可检测出iNOS cDNA表达。同第一种方法比，后一种操作简单，EFS诱导的勃起反应持续时间长，效果好，而毒副反应少。
Wesells等［12］分离到微血管内皮细胞（MVEC），并用PKH-26标记，注射入成年鼠阴茎海绵体，6～7天后，显微镜检阴茎冰冻切片发现被标记的细胞，体外阴茎组织培养亦发现有含染料的与MVEC相似细胞生长，并且阴茎中的转基因可稳定有效的表达。
Christ等［13］将编码一种特殊亚型的K通道——人类平滑肌maxi-K+通道（hslo）的裸DNA注射入大鼠阴茎海绵体，用EFS诱导阴茎勃起时的海绵体内压作为判断海绵体生理学改变的客观指标，同仅注射载体的以年龄配比的对照组相比，注射hslo cDNA的所有大鼠海绵体内压均非常显著增加，注射1～3个月后，该效果仍明显存在，此基因治疗机制可能与改善结合并表达外源人类K+通道基因的海绵体平滑肌细胞的超极化功能有关。这种超极化功能的改善可能是L-型电压依赖性Ca2+通道的跨膜转运被抑制的结果。最终导致细胞内钙浓度下降，加强平滑肌的舒张。
三、基因治疗的优点及待解决的问题
阴茎为体表器官，目的基因及其产物很容易转运到海绵体内；而且可用止血带压迫阴茎根部来阻止基因及其产物进入全身血液循环，直至这些基因或其产物被靶细胞吸收；静止状态时，阴茎内血流很慢（约5ml/min），可进一步增加基因及其产物的吸收。另外，阴茎血管平滑肌的更新很慢，因此，一个新转染的基因可起效数周至数月，一个阳萎患者每年接受3～4次基因注射，无需其它治疗便可保持其勃起功能。其次，基因治疗产生NOS是一种生理过程，即在阴茎疲软时，其高水平的NOS合成正常低水平的NO，故推测不会发生阴茎异常勃起，感染及其它副反应。最后是海绵体存在缝隙连接，使其成为一个功能性合胞体，因此，即使少数细胞转染目的基因，也足够产生有效的生理反应。
阳萎的基因治疗同其它疾病的基因治疗一样，还处于起步阶段，存在许多问题。主要问题是：寻找更多有价值的目的基因，构建组织特异性或定向基因表达载体，深入研究精确调控目的基因表达的机制，组建具有调控序列的基因等。
作者单位：430071 武汉 湖北医科大学泌尿外科男科学研究中心
参考文献
1 Bunett AL, Ricker DD, Chamness SL, et al.Localization of nitric oxide synthase in the reproductive organs of the male rat. Biol Reprod，1995,52∶1-7.
2 Padma Nathan H, Hellstrom WJ, Kaiser FE, et al. Treatment of men with erectile dysfunction with transurethral alprostadil. N Engl J Med, 1997, 336∶1-7.
3 Morales A, Gingell C, Collins M, et al. Clinical safety of oral sildenafil citrate (VIAGRATM) in the treatment of erectile dysfunction. Int J Impot Res, 1998,10∶69-73.
4 Mullignon RC. The basic science of gene therapy.Science,1993,260∶926-932.
5 Burnett AL. Nitric oxide in the penis:physiology and pathology.J Urol, 1997,157∶320-324.
6 Burnett AL, Lowenstein CJ, Bredt DS, et al. Nitric oxide: a physiological mediator of penile erection. Science, 1992,257∶401-404.
7 Magee M, Fuentes AM. Garban H, et al. Cloning of a novel neuronal nitric oxide sythase expressed in penis and lower urinary tract. Biochem Biophys Res Commun,1996,226∶145-151.
8 Garban H, Marquez D, Magee T, et al.Cloning of rat and human inducible penile nitric oxide synthase:application for gene therapy of erectile dysfunction. Biol Reprod,1997,56∶954-963.
9 Park JK, Kim W, Koh GY, et al. Deletion polymorphism in the gene for angiotensin converting enzyme in patients with erectile dysfunction. J Urol, 1998,159(suppl)∶96.
10 Felgner PL, Tsai YJ, Sukhu L,et al.Improved cationic lipid formulations for in vivo gene therapy. Ann Ny Acad Sci,1995,772∶126-129.
11 Vile RG, Rnssell SJ. Retroviruses as vectors.Br Med Bull, 1995,51∶12-30.
12 Wessells H, Williams SK.Endothelial cell transplantation into the corpus cavernosum: basis for efficient gene therapy for erectile dysfunction. J Urol,1998,159(suppl)∶92.
13 Christ J, Rehman J,Melman A,et al.Intracavernous injection of the hslo maxi-K cDNA: a test of the utility of gene therapy for the treatment of erectile dysfunction. Int J Impot Res, 1996,8∶103-107.
收稿：1998-08-13 修回：1999-03-02
∶103-107.
收稿：1998-08-13 修回：1999-03-02
|
