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奎宁与三种逆转剂联合对耐药细胞系K562/HHT多药耐药逆转作用的研究
中华血液学杂志 1998年第1期第19卷 论 著
作者：罗梅华 卞寿庚 冯敏 王承志 何一心 桂福民
单位：300020 天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院(罗梅华、卞寿庚、冯敏、何一心、桂福民)；天津市市内电话局(王承志)
关键词： 联合逆转剂；耐药细胞系；协同作用
本课题受中国医学科学院重点项目基金资助
摘要 目的:寻找有效的多药耐药联合逆转剂。方法:用MTT法、联合效应分析和流式细胞仪测定技术研究奎宁(Quin)分别与环孢菌素A(CsA)、他莫西酚(Tam)、潘生丁(DPM)联合逆转耐药细胞系K562/HHT对柔红霉素(DNR)和高三尖杉酯碱(HHT)耐药。结果:逆转倍数是单用药的2～3倍,达到或超过单用2倍剂量的逆转效果,逆转剂间有联合协同作用,其中Quin与DPM或Tam联合的协同作用大于Quin与CsA联合,可增加细胞内DNR浓度。结论:Quin与CsA、DPM或Tam联合具有协同作用,不同机制逆转剂联合的协同作用更为显著。
Synergistic reversal effect of quinine in combination with modulators on multidrug resistant cell line K562/HHT Luo Meihua,Bian Shougeng,Feng Min,et al.Blood Diseases Hospital and Institute of Hematology,CAMS and PUMC,Tianjin 300020
Abstract Objective:To develop effective combination of drug resistance modulators.Methods:The reversal effects of quinine(Quin) in combination with cyclosporin A (CsA),dipyridamole (DPM) or tamoxifen(Tam)，respectively on the drug resistance of K562/HHT were studied by MTT,flow cytometry and median-effect principle.Results:The reversal effectiveness of the modulator combinations was 2～3 times as much as that of each modulator alone.Synergistic interaction between Quin and DPM or Tam was greater than that between Quin and CsA.Quin combined with CsA increased intracellular DNR accumulation significantly as compared with either of them alone.Conclusion:There was synergistic interactions between Quin and CsA,DPM or Tam,and combination of modulators with different operating mechanisms had a greater synergistic interaction.
Key words Combined modulator Drug resistant cell line Synergistic interaction
我们曾报道环孢菌素A(CsA)、奎宁(Quin)、他莫西酚(Tam)和潘生丁(DPM)在体内副作用较低的血药浓度下对耐药细胞系K562/VCR、K562/HHT具有一定的逆转作用［1］。为进一步提高逆转效果,我们取Quin分别与CsA、DPM、Tam半量联合,研究了对耐药细胞系K562/HHT的逆转作用及其相互作用。
材料和方法
1 细胞系和培养条件 K562/HHT由本所细胞培养室赠,细胞系用含0.37μmol/L HHT的RPMI1640完全培养液长期培养,用前用无药物培养液培养2天后配成5×104/ml的细胞悬液备用。
2 药物 CsA(Sandoz,瑞士),Quin（Sigma),Tam(Sigma,溶于二甲基亚砜，浓度为20mmol/L),DPM(Sigma,溶于二甲基亚砜,浓度为20mmol/L)。DNR,HHT等药物均用生理盐水稀释成药物母液备用,二甲基亚砜的终浓度＜0.1%。
3 细胞与药物相互作用 用完全培养液将药物母液稀释成不同浓度的药物工作液,细胞悬液(空白孔为培养液)和药物工作液(对照孔为培养液)各100μl加入96孔板中，一式3份,37℃,5%CO2培养4天后进行MTT测定,测定方法详见文献［1］。
单用和联合逆转剂对K562/HHT的逆转作用的药物工作液分别为:①用药物剂量效应曲线DNR为0.01～5.50μmol/L,HHT为0.02～3.20μmol/L,分别配制7种浓度；②7种浓度的DNR或HHT加不同的逆转剂(各50μl,逆转剂为单用或联合),③不同的逆转剂。逆转剂的浓度分别为文献［1］中浓度(全量)的一半(半量),即Quin6.9μmol/L、CsA1.5μmol/L、DPM 2.5μmol/L、Tam 5μmol/L。
联合的逆转剂之间相互作用:药物工作液分别为:①7种浓度Quin，与Quin成一定浓度比例的CsA、DPM、Tam和培养液各50μl;②7种浓度的Quin及与Quin成一定浓度比例的CsA、DPM、Tam各50μl,浓度比例为各逆转剂单用IC50的浓度比,即Quin与CsA、DPM、Tam分别以2∶1,1∶5,1∶5联合(细胞悬液含DNR 0.17μmol/L,该浓度DNR对细胞系无毒性)；分别以2∶1,1∶10,1∶10联合(细胞悬液含HHT 0.37μmol/L)。
4 联合逆转剂相互作用的分析 用Chou's半效原则分析法评估按一定浓度比例联合的药物之间的相互作用,得出各细胞杀伤水平的联合指数(CI)值,CI＜1表示联合药物之间有协同作用,CI值越小协同作用越大,CI＝1为相加作用,CI＞1为拮抗作用［2］。将半效原则分析法的计算过程编成计算机程序,所有的CI值都用微机分析得出,协同作用的大小用CI50表示。
5 细胞内药物浓度测定 5×104/ml细胞悬液分别加或不加半量Quin、CsA、DPM、Tam及其联合与5.2μmol/L DNR 37℃孵育90分钟后用冰盐水洗涤2次,细胞悬浮在冰盐水中并保存在冰里,立即用流式细胞仪测定细胞内DNR的浓度。
结 果
K562/HHT耐药细胞系对DNR和HHT的耐药倍数分别为K562的34.80和100.76倍,半量Quin、CsA、DPM、Tam单用或联合而不加DNR或HHT时,使耐药细胞系K562/HHT细胞的存活率＞90%。
单用半量Quin、CsA、DPM、Tam使K562/HHT对DNR及HHT的耐药分别逆转2.0～29.3倍。联合逆转剂的逆转倍数分别是单用的2～3倍,达到或超过全量单用的效果(表1)。这些结果提示Quin与CsA、DPM、Tam之间存在协同作用。
我们进一步研究了联合药物之间的相互作用,结果显示,Quin与CsA、DPM、Tam分别以2∶1,1∶5,1∶5联合(对DNR)和以2∶1,1∶10,1∶10联合(对HHT)在20%以上杀伤水平的CI值＜1,表明Quin与CsA、DPM、Tam联合逆转细胞系K562/HHT对DNR和HHT耐药性具有协同作用。Quin与DPM或Tam联合时K562/HHT对DNR的CI50(0.6129,0.6058),对HHT的CI50(0.6309,0.5931)小于与CsA联合的CI50(0.8874,0.8312)(P＜0.05,表2),说明Quin与DPM或Tam联合的协同作用大于与CsA联合。
表1 单用和联合逆转剂对耐药细胞系K562/HHT的逆转作用
| 药物 |
浓度
(μmol/L) |
DNR |
HHT |
| IC50 |
逆转
倍数 |
IC50 |
逆转
倍数 |
| 对照 |
|
1.4490 |
|
4.6404 |
| Quin |
13.8 |
0.1761 |
8.2 |
0.1499 |
31.0 |
| |
6.9 |
0.2874 |
5.0 |
0.2569 |
18.1 |
| CsA |
3.0 |
0.0576 |
25.2 |
0.0550 |
84.4 |
| |
1.5 |
0.1675 |
8.8 |
0.1583 |
29.3 |
| DPM |
5.0 |
0.4714 |
3.1 |
0.5448 |
8.5 |
| |
2.5 |
0.4361 |
3.3 |
0.8807 |
5.3 |
| Tam |
10.0 |
0.2124 |
6.8 |
1.7073 |
2.7 |
| |
5.0 |
0.6141 |
2.4 |
2.3125 |
2.0 |
| Quin+CsA |
6.9+1.5 |
0.0721 |
20.1 |
0.0719 |
64.5 |
| Quin+DPM |
6.9+2.5 |
0.1332 |
10.9 |
0.0861 |
53.9 |
| Quin+Tam |
6.9+5.0 |
0.1089 |
13.3 |
0.0934 |
49.7 |
表2 不同的逆转剂联合逆转耐药细胞系K562/HHT对DNR、HHT耐药的协同作用的比较
| 药物 |
CI50 |
| DNR |
HHT |
| Quin+CsA |
0.8874 |
0.8312 |
| Quin+DPM |
0.6129 |
0.6309 |
| Quin+Tam |
0.6058 |
0.5931 |
Quin + CsA 与Quin + DPM、 Quin + Tam相比较，P值＜0.05 细胞毒性试验显示Quin分别与CsA、DPM、Tam有协同作用,我们用流式细胞仪测定了Quin分别与CsA、DPM、Tam联合及单用时对K562/HHT细胞内DNR浓度的影响,单用Quin或CsA时可使细胞内DNR浓度增加,联合Quin与CsA时使细胞内DNR浓度增加更明显，并且显著高于两者单用(P＜0.05),但单用DPM和Tam时细胞内DNR浓度无变化,Quin与DPM或Tam联合时细胞内DNR浓度与单用Quin无差别。
讨 论
我们曾报道Quin5μg/ml、CsA3μmol/L、DPM 5μmol/L、Tam 10μmol/L时对耐药细胞系均有一定的逆转作用,但这些浓度多为大剂量的平均血药浓度,对人体有一定的副作用,我们将Quin分别与CsA、DPM、Tam按半量上述浓度联合以期达到全量单用的效果,而Quin与CsA、DPM、Tam无相同副作用,这样可大大减少药物的治疗毒性。半量单用的逆转倍数是全量的1/2～1/3,但半量联合的逆转倍数达到或超过全量单用的逆转效果。联合效应分析证明Quin与CsA、DPM、Tam有协同作用,其中Quin与DPM、Tam的协同作用大于与CsA联合。
Quin和CsA主要是通过与化疗药物竞争和p170结合使细胞内药物浓度增加而逆转耐药［3］,我们联合应用Quin与CsA使细胞内DNR浓度的增加明显地高于二者单用(P＜0.05),提示两者在增加细胞内药物浓度方面有协同作用,这可能是它们协同性地增加DNR和HHT对耐药细胞毒性的机制之一。Howell等［4］报道DPM以浓度依赖方式增加卵巢癌耐药细胞系2008细胞内的足叶乙甙(Vp16)浓度,DPM 2μmol/L时细胞内Vp16浓度增加不明显,达4μmol/L时细胞内Vp16浓度增加到2倍,至20μmol/L时达3.2倍。Shalinsky等［5］报道DPM和VRP同样程度地增加耐药细胞系KB-GRC1细胞内秋水仙素(COL)浓度,可协同作用只存在于DPM与COL之间,VRP与COL之间则没有;DPM使耐药细胞系KBV1细胞内长春花碱(VBL)浓度增加远大于细胞系KB-GRC1,但DPM与VBL对KBV1的协同作用小于对KB-GRC1,于是认为VBL和DPM的协同作用存在比增加细胞内药物浓度更复杂的机制,可能为改变细胞内药物的分布、结合等。Chatterjee等［6］报道Tam10μmol/L使耐药细胞系CHO-Adr对ADR的耐药逆转15倍,但细胞内ADR的浓度无明显增加,他们认为细胞内药物浓度的增加可能不是Tam逆转多药耐药的机制之一,它很可能是通过蛋白激酶C和钙调蛋白逆转多药耐药。我们单用半量DPM、Tam未能增加细胞内药物浓度,DPM或Tam分别与Quin联合,细胞内DNR浓度的增加与单用Quin无差别。我们认为半量DPM、Tam逆转耐药机制不同于通过增加细胞内药物浓度的Quin,而是通过其它机制,它们的协同逆转耐药,可能是通过抑制蛋白激酶C,改变细胞内药物分布、结合及钙调蛋白等其他不同机制的协同作用。Quin与DPM或Tam联合的协同作用大于Quin与CsA联合,亦可能为不同机制的逆转剂联合的协同作用大于相同机制的逆转剂联合。
参 考 文 献
1 罗梅华，卞寿庚，薛艳萍，等.五种逆转剂对耐药细胞系K562/VCR和K562/HHT逆转作用的研究.中华血液学杂志，1995，8:429-430.
2 Chou TC.Assessment of synergistic and antagonistic effects of chemotherapeutic agents in vitro.In:Kochli OR,Sevin BU,Haller U,eds.Chemosensitivity testing in gynelgic malignancies and breast cancer.Contrib Gynecl Obset.Basel：Karger, 1994.19:91-107.
3 Nooter K,Sonneveld P,Ostrum R,et al.Overexpression of the mdr1 gene blast cell from patients with acute myelocytic leukemia is associated with decreased anthracycline accumulation that can be restored by cyclosporin-A. Int J Cancer，1990，45:263-268.
4 Howell SB,Hom DK,Sanga R,et al.Comparison of the synergistic potentiation of etoposide,doxorubicin,and vinblastine cytotoxicity by dipyridamole.Cancer Res,1989,49:3178-3183.
5 Shalinsky DR,Andreeff M，Howell SB.Modulation of drug sensitivity by dipyrimole in multidrug resistance tumor cells in vitro.Cancer Res，1990，50:7537-7543.
6 Chatterjee M,Harris AL.Reversal of acquired resistance to adriamycin in CHO cells by tamoxifen and 4-hydroxy tamoxifen role of drug interaction with alpha 1 acid glycoprotein.Br J Cancer，1990，62:712-717.
(收稿：1997-03-26 修回：1997-08-14)
(校对：徐丽娟)
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