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汉坦病毒感染（HFRS及HPS）研究进展
国外医学病毒学分册1999年第6卷第1期
（第四届国际HFRS及汉坦病毒会议，1998年3月5～7日，亚特兰大）
宋 干 李德新 杭长寿 董关木编译
[摘要] 1998年3月5～7日第四届国际肾综合征出血热（HFRS）及汉坦病毒（Hantaviruses,HV）会议在美国亚特兰大召开，交流了1995年6月第三届会议后3年来在有关HV感染（HFRS及HPS）与HV研究方面的新进展，来自世界各国的250余名代表参加了会议，我国有7位专家应邀参加会议。此次会议由美国疾病控制和预防中心（CDC）负责组织，会议按内容分9个部分进行交流：临床、发现机理和免疫应答，实验诊断，生态学，流行病学，健康教育和预防，病毒/宿主遗传性分析，分子生物学和细胞相互作用，抗病毒药物和疫苗研制。我国学者通过大会报告或墙展介绍了我国在疫苗，流行病学（包括螨媒）、分子生物学等方面的研究进展和经验。本文从流行病学、汉坦病毒的遗传和分子生物学及汉坦病毒的致病性和免疫应答、抗病毒药物和疫苗三个方面介绍国外主要的研究新进展。
一、汉坦病毒感染的流行病学近况
1 HFRS
1.1 韩国，近年每年发病约1 000例，几乎全部集中在秋冬大高峰期（10～12月），少数见于小峰期，近年小峰期病例明显减少。1990年后部队中发病明显减少，与当年起开展疫苗接种有关。迄今在韩国已接种近700万剂量Ⅰ型疫苗。目前韩国HFRS的病死率为2.8%（70年代为16.6%～25.8%）。
1.2 俄罗斯：HFRS在该国自然疫源性疾病发病率中占首位。1930年开始发现，1978年定为法定报告疾病。1978～1996年共发生HFRS91603例（61/89行政区），其中欧洲部分88322例（46/60行政区），占96.4%，年平均发病率为4.1/10万人口；亚洲部分3281例（15/29行政区）占3.6%，年平均发病率为0.6/10万人口）。1997年前9个月农村发病率升高3.5倍，欧洲部分高发区升高5倍，1997年在Bashkortostan的流行中，血清学证实9430例（包括493例儿童），发病率达224.5/10万（其首都Ufa,503.8/10万）比1996年增高5.6倍，且重症多（占22%），病死率为0.35%。发病高峰在10～11月。其欧洲部分流行的是普马拉病毒（Puumala virus）引起的流行性肾病（NE），也存在少数汉城病毒引起的家鼠型出血热，在其亚洲远东地区，主要流行姬鼠型出血热，亦有家鼠型，流行季节在欧洲部分为夏秋季，亚洲部分为秋冬季。已从47种小型哺乳动物查到HV抗原；欧洲33种，远东18种，西伯利亚10种，另有13种鸟类，从8种鼠类及从病人和尸检标本分离到100余株HV，血清学和基因分型证明，至少有6种不同的型，包括：汉滩、汉城、普马拉、图拉、哈巴罗夫斯克（Khabarovsk）及Taimyr/Topografov，近年又发现有多布拉伐（Dobravna）病毒。
1.3 南斯拉夫：1952年发现首例HFRS病人，其后每年有散发，迄今已发现6000余例，1961年第一次在林区一军营中发生爆发，46个士兵患病，病死率2.1%。1967年第二次流行，有200多病人，病死率为2.5%，间断19年后，1986年在前南斯拉夫所有6个共和国2个省发生流行，血清学证实161例，病死率为6.8%，1989年再次大爆发，发现609例可疑病人，其中226例经血清学证实，1995年再次流行，发病500多例，血清学证实400余例，实际感染估计有3000人，同期检查鼠类血清抗体和鼠肺抗原，黄喉姬鼠46.5%阳性，林姬鼠19.3%阳性，黑母姬鼠5.6%阳性，欧洲棕背鼠57%阳性。在前南斯拉夫辖区的上述多次流行，比较集中在Bosnia, herqegovinia, Serbia及Croatia涉及目前的交战地区。可见HFRS在这个地区的流行逐年加剧，与战争所造成的破坏和贫困可能有关。在南斯拉夫及其它巴尔干国家，存在临床轻重不同的HFRS，由不同鼠种携带的不同型的HV传播引起，包括欧洲棕背鼠传播普马拉病毒引起的轻型HFRS（流行性肾病）；黄喉鼠和黑线姬鼠传播汉城型和多布拉伐型病毒引起的重型HFRS（家鼠型出血热）。值得注意的是，多布拉伐型病毒已在巴尔干国家以外的俄罗斯、奥地利、爱沙尼亚等欧洲国家发现，而多布拉伐病毒在黑线姬鼠中亦有携带，因而在黑线姬鼠及黄喉鼠分布地区均应注意检测，确定引起姬鼠型出血热的两型HV的存在情况，为有针对性的研究和防治依据。
1.4 其它国家/地区：（1）日本：1960～1970年在大阪发生119例城市型EHF，死2例，1970～1984年在21个单位发生实验动物型EHF126例，死1例。1985年后未再发生病人，但在国际港口城市褐家鼠中仍经常能检测到带病毒（SEOV）鼠。基因分析，从北海道分离的家鼠型病毒K1株与日本株SR11株及B1株比与80～39株（韩国株）和R22株（中国株）更接近。从北海道的棕背鼠查见与PUUV相近病毒抗原和基因，表明有该型病毒存在。（2）台湾：据台北预防医学研究所Chiueh等报道，应用5个型HV（HTN，SFO，PUU，PHV，SNV）混合抗原ELISA法检查14种啮齿目和2种食虫目动物血清5855份，总抗体阳性率为8.6%最高为褐家鼠和黑家鼠，分别为22.7%（426/1875）及8.4%(50-597)。黑线姬鼠中未查见阳性鼠。对HV病毒血症鼠血，采用RT-PCR及Nested-PCR进一步证实家鼠中病毒携带现象。人群中HV抗体流行率为0.88%(32/3635)。港口工人和收垃圾者较高，为3.08%（47/1526），慢性肾衰及未明热症病人亦较高，分别为7.1%(4/51)和6.4%（5/78）。表明台湾为家鼠型EHF疫区，并可能存在轻型病人。（3）此外，在越南胡志明市检测92份正常人及58份家鼠血清HV抗体全为阴性，而在78份有出血热综合征病人血清（登革抗体阴性），26.9%抗体阳性，其中35.9%对HTNV抗原反应阳性；从泰国的板齿鼠分离出1株HTNV及2株SEOV。在印尼和斯里兰卡的血清学亦证明有家鼠型EHF存在。
2 HPS
2.1 北美：1993年首次发现HPS后，截至1998年3月美国28个州已确诊178例病人，加拿大3个省发生22例。在北美，HPS的病原主要是辛诺柏病毒（sin nombre virus,SNV），其啮齿类宿主为鹿鼠（Peromyscus maniculatus）。另有几种与SNV相近的病毒，亦为HPS的病原，包括纽约病毒（new york virus,NYV），由白足鼠携带，已知有2例病人与NYV有联系；黑港渠病毒（black creek canal virus,BCCV）,由刺毛棉鼠（sigmodon hispidus）携带，在路易斯安纳州发生的HPS与之有关；长沼病毒（bayou virus,BAYV），由米鼠（oryzomys palustris）携带，在德克萨斯州的HPS与之有关，此外，在北美还有多种新发现由田鼠携带的HV，包括Isla vista病毒（由M. californicus携带），EL Moro Canyon病毒（ELMCV），由西方收获鼠（reithrodontomys megalotis携带）Muleshoe病毒由棉鼠（sigmodon texensis）携带，它们对人的致病作用尚不够清楚。
2.2 中南美：迄今至少有179例确诊HPS病人发生在中南美5个国家：阿根廷105例，巴拉圭34例，智利29例，巴西6例，乌拉圭2例。阿根廷和智利的HPS由Andes病毒引起，在巴西由Juquitiba病毒引起，在巴拉圭由Leguna negra病毒引起。在中南美至少还有其它5种HV，其与HPS的关系尚不清楚，如秘鲁的Punchana病毒，委内瑞拉的Cano delgadito病毒，玻利维亚的Rio Mamore病毒等。在中南美的HV的宿主动物，Oligryzomys longicaudatus(长尾小米鼠)携带Andes病毒，Calomys laucha携带Leguna病毒及Leguna negra 病毒,刺毛鼠（neacomyss pinosus）携带Punchana病毒，墨西哥收获鼠（reithrodontomys mexicanus）携带Rio segando病毒，西方收获鼠携带EL Moro Canyon病毒，而Juquitiba病毒的宿主动物尚不清楚。第一起人-人传播的HPS发生在阿根廷西部，由Andes病毒引起。据CDC调查，开始的病例是一位医生，他曾护送一病人去医院。而新近发现有几名保健人员血清HV抗体阳性，无一有人一人传播的明确证据，在智利，1995年10月4日～1997年10月8日发生HPS21例，死13例（62%）。在Aysen省两个地区发生两起家庭小爆发：一起从7月25～日-9月5日先后发生5例HPS，死1例；另一起从8月23日～28日在一4口人的家庭，发病3人，据认为与当地很高的鼠密度有关（37～50%）。智利的HPS有6例小于17岁的儿童，其中至少3例有瘀斑（petechiae），而所有成年病人均有显微血尿及管型，此与北美HPS病人无肾损及出血表现不同（与BCC及BAY病毒有关的少数病人伴有肾损症状）。
从上述两种HV感染在世界上流行分布（中国的发病资料未列）可以看出，不同型HV各有其特有的主要（原始）储存宿主鼠种，而这些有关鼠种又各有其特有的地理分布，后者又决定了两种临床型HV感染的主要地理分布。美国、俄国和南斯拉夫均已查出有多种血清型的HV存在，而中国是发病占世界发病总数90%以上的的出血热大国，流行历史亦最长，迄今还只证实有两个血清型HV，事实上决不止此。没有将实际存在的致病和不致病的HV都查出、查清，表明我国与国际水平有很大差距。为此，建议把发现新的致病HV的任务提到重要日程上来，由国家提供主要经费，力求尽快解决，为在我国全面研究和解决HV感染提供条件。同时应尽快引进国外新的HV型的参考毒种，及推广应用国外最先进的病原学检测技术方法。
二、汉坦病毒的遗传和分子生物学
在至今尚未有HFRS报告的波兰发现存在Tula病毒，从动物的肺组织扩增了全长的S片段和G2糖蛋白的编码区，并测定了它们的核苷酸序列。同源性比较发现，波兰Tula病毒和其他Tula病毒的S片段的同源性为83.9%～85.2%，G2编码区的同源性为85.4%～86.6%，而核蛋白和G2的氨基酸序列的同源性大于96%。进化树分析发现这些Tula病毒和俄国中部的Tula病毒很接近，但还是有一定距离。乳小鼠和黑线姬鼠对这些图拉（Tula）病毒不敏感，但是刚断乳的沙鼠则较敏感。对斯洛伐克相距350公里的两个地方发现的Tula病毒进行了核苷酸序列测定，发现核蛋白的编码区序列有19%的不同。西斯洛伐克的病毒接近捷克Tula病毒的序列，而东斯洛伐克的病毒接近俄国中部的Tula病毒。
用杆状病毒表达的CC107核蛋白免疫动物，建立了一些抗SNV的单克隆抗体，其中19D可以识别NY-1、SNV、BAY、Muleshoe、Rio mamore和PUU病毒，而单克隆抗体12D17仅能识别SNV、BAY和Muleshoe，不能识别NY-1、Rio mamore和PUU病毒。这两株单克隆抗体的识别位点均在核蛋白的第17～59氨基酸。SNV和NY-1的第30位氨基酸不同，SNV是精氨酸，NY-1为赖氨酸，用点突变的方法将NY-1的赖氨酸替换成精氨酸后，12D1则可以识别此NY-1。
用噬菌体显示技术发现HFRS病人血清均可以和汉坦病毒核蛋白N端的119个氨基酸反应。用基因片段噬菌体显示肽库筛选到YPWH四肽，可以和识别G2单克隆抗体GDO-5反应。
研究了汉坦病毒G1、G2糖蛋白在细胞内的定位，G1和G2双体在Golgi体的定位，主要依赖于G1，G2的胞浆内位点起到稳定作用。G1氨基酸的替换造成的构相改变将影响G1、G2双体的形成。
进行了汉坦病毒持续性感染的分子生物学研究。在汉坦病毒感染后的6～46和2～139天，用Northern杂交、引物延伸，RNase保护、RT-PCR、克隆和序列测定等方法对病毒的生物学特性进行了研究。结果显示，在感染期间，L、M和S片段的vRNA和cRNA/mRNA的浓度有变化，RNA浓度和病毒滴度在感染的第1～2周最高，以后逐渐下降。未发现大的核苷酸序列改变，没有发现D1颗粒和RNA分子内缺失。L片段的vRNA和cRNA的5´和3´末端发现有核苷酸缺失，并在包装到病毒颗粒内的L片段RNA发现同样的缺失。由于这些缺失常包括最末端的19个硷基，由于这些硷基和病毒RNA的复制、转录和包装有关，所以这些缺失的RNA的病毒的持续感染中起重要作用。
测定了中国分离HFRS病毒的R22、L99、HB55和A9的M和S片段核苷酸序列，A9和76～118株的核苷酸同源性为84.75%，氨基酸的同源性为96.83%。R22、L99和HB55与Seoul80～39的核苷酸同源性分别为95.3%、95.5%和95.6%、氨基酸的同源性分别为98.9%、99.4%和99.4%。
三、汉坦病毒的致病性和免疫应答及抗病毒药物和疫苗研究
1 病毒的致病性和免疫应答
1993年首次在美国西南部地区发现并证实的汉坦病毒肺综合征（HPS）正呈不断扩大之势，至1997年，不仅在美国的28个州确诊了173例病人，而且加拿大和南美的智利、阿根廷等国也发现HPS的流行，为此，美国、加拿大、阿根廷、智利等国研究人员对病毒的致病性和免疫应答进行了广泛、深入的研究。
美国新墨西哥大学的F.A.Enris等对引起汉坦病毒肺综合征（HPS）的辛诺柏病毒（SNV）及致HPS相关病毒的致病性进行了研究，观察到HPS病例均存在毛细血管通透性增加综合征，故推测，在该病毒感染中，是由于对汉坦病毒（HV）特异的CD8和CD4阳性的T淋巴细胞引发了肺和肾脏疾患，因此，他们用从HPS病人的外周血中分离淋巴细胞（PBMC），用白细胞介素-2或者用有表达SNV蛋白的重组痘苗病毒刺激后培养，结果发现，这些人的CD8和CD4阳性T淋巴细胞克隆株与HPS病毒有很强的特异性，但各株间的交叉反应很复杂，这些T细胞克隆能识别不同分离株HTN病毒中的高保守区域，但有些克隆却不能识别只有一个氨基酸转换后的病毒，而有些T细胞克隆却能识别由靶细胞表达其遗传距离较远的病毒株序列，如Andes和PUU病毒序列。因此，他们认为在HPS的发病中，T细胞表位的交叉反应可能是很重要的，同时对于疫苗的设计，这种复杂T细胞交叉反应应予高度重视。Koster等认为，HPS发生肺水肿以前其抗SNV的特异性IgM和IgG已在血循环中存在。因此，应注意发生肺水肿和毛细血管通透性增加是与哪一种淋巴母细胞有关。为此，他们在对11个病例的检查和分析中发现，11例HPS无一例存在免疫复合物。只有其中一例检验到抗血小板糖蛋白的IgG，血浆中C3a,C4a和C5a等补体成分正常或稍高。而在不同病期进行的外周血涂片计数淋巴母细胞表明，多为CD3、CD8和CD4淋巴细胞，表明，肺水肿和胸膜渗出是由于T细胞介导的免疫病理所致，而非B细胞所为。
Koster等进一步收集了自1993年至1997年的23例HPS病人的白细胞进行HLA分析，根据分析的结果认为，HPS是由于SNV与细胞上的HLA的Ⅰ级等位基因B35和CWO7有关，是针对SNV核衣壳上的抗原点起反应，这些资料与HPS是由T细胞介导的免疫致病性相一致。
美国CDC的 Sundstrom等用SNV和HTN病毒感染人肺毛细血管内皮细胞，发现两种病毒感染后，细胞分泌的IL-1，IL-6和IL-8及MIP等细胞因子是相似的，而在感染早期，SNV和HTN病毒促使其血管内皮细胞分泌粘附性分子的模式则不同，这可能是两种病毒所致的临床症状不同的原因之一。
阿根廷Hjelle从病理上对Andes病毒引起的HPS进行了研究，发现Andes病毒所致的主要病理改变为肺水肿，胸膜渗出等，呈现间质性肺炎的病理表现，另外有胸隔膜水肿，肝脏肝门区有单核细胞浸润，而无肾实质区炎症，但在大部分组织的血管内皮细胞中可见到病毒N蛋白抗原的分布，包括肾小球内皮细胞。
我国第四军医大学的杨守京在HTV病毒感染的大鼠体内发现肝细胞，肾集合小管细胞中存在特异性IgG和IgM，并可检测到HTN的RNA，肾近端小管细胞内IgG和IgM且有C3补体存在，通常有玻璃样变性，显示细胞内存在有免疫复合物的沉积，此结果与HPS的病理变化显著的不同点是，HTN有免疫复合物的参与，而HPS未查到免疫复合物而倾向于T细胞所致的免疫病理。
在宿主动物带病毒，感染途径的研究中，美国Jeor采用反复捕捉，释放同一啮齿动物，并接种SNV，观察其体内自然状态下带病毒情况，结果发现，当动物感染SNV时，带病毒可持续数周乃至数月，病毒抗原可以在血液、肝、肾、肺、脾和唾液中存在，但当抗体出现时，病毒抗原在血液中消失，但可在其它脏器中残留。同一株病毒，在同一啮齿类动物中，在整个捕捉一释放（2次或2次以上）过程中，分离到的病毒不管是M片段抑或是S片段以及非编码区片段均完全一样，但在不同种啮齿动物上述区域的序列有改变，说明汉坦病毒有其特殊的宿主动物依赖性。Jeor认为，既然SNV可在唾液中存在，那么就可能存在经口传播的可能性，智利的Bharadwaj也报道圣地亚哥附近—14岁女孩在休假期间患HPS，但她在发病前未见到任何鼠类，而在治疗过程中使用吸痰器时，从吸出的痰液样品中检测到了特异性Andes病毒的RNA，因此他们认为存在人-人间传播的可能性。
不但HPS病毒，日本的Kariwa等以新生白鼠经口接种病毒的实验同样表明HV也存在经口传播的可能。他们将出生不超过24小时的新生大白鼠给以0.1ml的抗SEO免疫血清，给药后16小时经口腔接种无细胞SEO型病毒或已感染SEO病毒培养物的Vero-E6细胞，同时以不给兔血清的新生大白鼠做对照。结果发现，当接种无细胞病毒培养物的动物，对照组动物均能在肺部测到病毒RNA（PCR），而实验组只有1/4动物受感染。当接种感染病毒的Vero-E6细胞时，不但对照组全部动物均阳性，而且实验亦只有1/4能保护，而且体外以免疫血清分别与无细胞病毒和感染病毒的细胞在37℃条件下中和1小时，再分别接种动物，结果前者全部中和，所有动物均测不到病毒RNA，而后者全部感染了病毒，表明，即使体内存在有中和抗体的大白鼠也存在经口传播HV的可能。
2 抗病毒药物和疫苗研究进展
至今为止，HFRS疫苗正式应用的主要是中国和南朝鲜，对已上市的疫苗，我国流研所陈化新等报告了我国三种单价灭活疫苗的血清学和防病效果，认为三种疫苗安全性均较好，副反应仅0.03%～3.26%，全程免疫后的中和抗体地鼠肾细胞苗为78.36%，上海沙鼠肾细胞苗57.81%，天元沙鼠肾细胞苗70%和兰州鼠脑纯化苗为51.09%，两种细胞苗1年后和2年的保护率分别为97.81%和88.73%、94.08%和91.22%、100%和100%。兰州苗亦为100%。
上海医科大学徐志一等在浙江建德县从1994～1997年以沙鼠肾细胞苗的观察表明，该地区HFRS的发病率HTN和SEL型分别为70%和30%，结果7966人的对照组发病13例，而3针全程注射疫苗的免疫组7 943人中无病例发生，保护率100%，且无不良反应。我国生产的沙鼠肾细胞双价疫苗人体观察总副反应率2.5%，免疫效价IFA血清阳转率100%，GMT67，中和抗体阳性转率对HTN型87.6%，对SEO型96.3%，显示该疫苗有良好的免疫原性。
韩国生产的商品化疫苗Hantavax，据Asan生命科学研究所的WOO报道，2针基础全程免疫后免疫荧光抗体（IFA）和高密度颗粒凝集试验（HDPA）阳性率为42.5%和45%，中和抗阳性率为13%，但加强免疫后IFA和HDPA可达80%，且几何平均滴度达128，但汉城医学院儿科系的Sohn等同样用Huntavax疫苗进行人体观察，中和抗阳转率仅为16.7%，他们认为该疫苗产生中和抗体的能力很低。
拉托维亚D.Koletzui等报道，通常将＞100个氨基酸的核酸序列插入到HBV核心蛋白将干扰它自身装配和颗粒形成的来，他们新构建了一个叫嵌镶颗粒（mosaic particles）系统，是引入对含有编码核心蛋白和Hantaam病毒白片段的转录中止密码的联接子构建而成，在大肠杆菌中可联合表达和联合装配核心蛋白和通读融合蛋白，结果显示，该嵌镶颗粒能表达HBC和HV抗原，即使该抗原不加佐剂，免疫啮齿动物棕背鼠，也能产生特异性的抗HBS和HV的抗体。
美国陆军传染病研究所K.Karmrud等正研究多价核酸疫苗，他们制备的DNA疫苗和以Sindbis病毒为载体的表达HTN病毒M和S基因产物的基因工程疫苗，正在以啮齿动物为模型进行免疫原性和保护效果的验证。
瑞典微生物学和肿瘤生物学中心以及我国病毒科学研究所梁米芳等采用基因文库技术，用PCR技术扩增病人特异性抗体Fab的重链和轻链基因，将该基因转入噬菌体载体pComb3，转染细菌，并通过5～6轮的富集选择，能在噬菌体表面表达特异性人抗体Fab片段，该研究将对了解HTN病毒的G1和G2蛋白在人体保护性免疫反应中的地位，而且是抗HTN病毒的被动免疫治疗中的一种较自然Ig的理想产品。
在抗病毒化学药的研究中，美国的W.E.Severson等报道病毒唑的抗HTN病毒的效果，体外试验证明，病毒唑抗HTN病毒的药理作用是直接抑制病毒的多聚酶活性，同时亦降低病毒mRNA水平和病毒蛋白。
[根据（Thefocnth international Conference on HFRS Hemowhagic and hantavirases,5～7 march,1998,Atlanta,USA）会议论文资料整理]
校对时间：99-12-8 17:45 何娟迎
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