嵌合体防龋疫苗的研究进展

　　国外医学口腔医学分册1999年9月第26卷第5期

华西医科大学口腔医学院

杨锦波综述 刘天佳审校

　　摘要　嵌合体防龋疫苗是将变链球菌的毒力因子葡糖基转移酶和表面蛋白，或分别与霍乱毒素亚单位相嵌合，依据嵌合方式不同，分化学嵌合、基因工程嵌合、直接嵌合基因免疫。对不同方式嵌合防龋疫苗的研究，有助于比较疫苗的有效性，为免疫防龋提供理论依据。

　　关键词　 防龋疫苗 嵌合 变链球菌 表面蛋白 葡糖基转移酶

　　嵌合体疫苗是指两个及两个以上的抗原蛋白通过化学共价键结合，或间接通过基因工程方法获得嵌合抗原蛋白，以及运用含有嵌合基因的真核表达质粒直接免疫，诱发机体产生针对多种抗原的保护性免疫^[1]。变链球菌是主要致龋菌，其重要毒力因子为葡糖基转移酶（glucosyl transferases,GTFs）和表现蛋白。GTFs和表现蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性，是目前研究防龋疫苗较理想的抗原蛋白。口腔中的抗体主要来自唾液腺的S-IgA和少量的血清IgG,S-IgA的形成需通过共同粘膜免疫系统。在机体的粘膜组织附近分布着大量的淋巴组织，这些粘膜相关淋巴组织在刺激部位接受抗原刺激后，致敏淋巴组织通过游走，归巢而达到其他部位的粘膜组织，即效应部位，并合成、分泌特异抗体^[2]。诱发粘膜免疫，产生高效、持久的S-IgA是近来嵌合体防龋疫苗研究的主要方向。本文依据获得嵌合体抗原蛋白的不同方式，分别概述嵌合体防龋疫苗的研究现状。

　　1 变链球菌表面蛋白（Ag Ⅰ/Ⅱ）与霍乱毒素B亚单位（cholera toxin B subunit,CTB）嵌合疫苗

　　近年来研究发现，CTB是有很强的粘膜免疫增强作用，不少学者将AgⅠ/Ⅱ与CTB化学偶联，以此嵌合体免疫动物，获得了明显的防龋效果^[3]。

　　AgⅠ/Ⅱ包括两个重复氨基酸序列，一个位于N端，富含丙氨酸，称A区，又称唾液成分结合区（saliva binding region,SBR），一个位于C端，富含脯氨酸^[4]。霍乱毒素由B亚单位和A亚单位构成，其中A亚单位由两段肽构成，A1为毒性亚单位，A2与A1和B之间起桥梁联接作用。B亚单位与哺乳动物细胞膜成分GM1神经节苷脂有强亲和力，是其作为粘膜免疫佐剂的结构基础。目前AgⅠ/Ⅱ与CTB化学偶联的方法是CTB和AgⅠ/Ⅱ分别与N-Succinimidyl(3-[2-Pyriyl]-dithio)propionate(SPDP)结合，形成CTB-SPDP，AgⅠ/Ⅱ－SPDP,在室温又与二硫苏糖醇混合，再经还原和平衡过柱，获得的AgⅠ/Ⅱ溶液与等摩尔的CTB-SPDP混合，最后经透析得到AgⅠ/Ⅱ-CTB嵌合蛋白。通过ELISA证实嵌合体结合GM1神经节苷脂的能力及AgⅠ/Ⅱ的免疫活性^[5]。Katz用相同方法获得的AgⅠ/Ⅱ-CTB经鼻腔免疫的Fischer鼠，与经口感染变链菌的相同鼠为对照，经ELISA测定，免疫组抗AgⅠ/Ⅱ的S-IgA为对照组的4倍，且免疫组小鼠下颌牙菌斑中的变链菌和龋均明显低于对照组^[6]。同样Russell用AgⅠ/Ⅱ-CTB经口免疫大鼠，经2-3次免疫，鼠产生抗AgⅠ/Ⅱ的S-IgA，至5-6月时仍能用ELISA检测出S-IgA^[7]。

　　2　因工程嵌合疫苗

　　2.1　AgⅠ/ⅡA区与GTFs基因工程嵌合疫苗

　　GTFs是由1500个氨基酸组成的具有高度同源序列的蛋白质，其N端为蔗糖结合区（sucrose binding,SB）,C端为葡聚糖结合区（glucan binding,GB）^[8]。Yu等^[9]用基因重组方法获得了AgⅠ/Ⅱ的A区与GTF的SB区或GB区嵌合的抗原蛋白，方法为：经PCR分别获得编码GTF-SB区、GTF-GB区和AgⅠ/Ⅱ a区的基因，分别将编码GTF-GB区段和GTF-SB区段的基因插入质粒pBlue scriptⅡ，得到质粒pBlue GB、pBlue SB，编码 AgⅠ/Ⅱ A区的基因插入质粒pACA202。质粒pBlue gB，pBlue SB以相同内切酶酶切，分别插入pACA202得到含有嵌合基因的质粒，再插入原核表达质粒，最后得到含有嵌合基因AgⅠ/ⅡA区-GB，AgⅠ/ⅡA区-SB的表达质粒pQEPG22,pQEPG23,转染E.colix- li-Blue。得到的表达产物免疫兔后发现，用AgⅠ/ⅡA区-GB免疫产生的IgG既能抑制葡聚糖的合成，又能抑制变链菌对唾液包被的羟基磷灰古的非蔗糖依赖型粘附。而用AgⅠ/ⅡA区-SB免疫产生的抗体不能抑制葡聚糖的合成，只能抑制非蔗糖依赖型粘附。推测可能是抗AgⅠ/ⅡA-SB的抗体不能进入结合GTFs的催化区，或不能识别GTFs的构象^[10]。

　　2.2　GTF-SB区与CTB基因工程嵌合疫苗

　　1996年，Laloi^[11]先人工合成编码GTF的SB区基因的寡核苷酸序列，将此序列插入质粒pVA1542（不含启动子，含ctb基因），得到含有编码SB-CTB基因的嵌合质粒，最后将此嵌合基因插入带有启动子的表达载体pT-7-7，构建出表达载体PT7，将pT7转染E.coli，获得的表达产物免疫兔后产生了既抗GTFs，又抗CTB的抗血清，且抗血清能抑制50%的GTFs的酶活性。

　　2.3　AgⅠ/Ⅱ与CTA2B基因工程嵌合疫苗

　　1995年，Hajishengallis等^[12]将编码变链菌AgⅠ/Ⅱ唾液结合区（sucrose binding region,SBR）的基因与编码霍乱毒素A2B亚单位的基因嵌合，其嵌合质粒的构建为：以含有霍乱毒素基因的质粒pRIT1080为模板，设计有XhoⅠ、Bpul1021酶切位点的引物，得到编码A2B亚单位的基因克隆，再亚克隆入含有XhoⅠ、Bpul1021酶切位点的质粒pET206，得到重组质粒pCT △A1，再以含有AgⅠ/Ⅱ sBR基因的质粒为模板，在引物设计中分别加入Ncol,xhoⅠ酶切位点，得到编码SBR的基因克隆，再插入质粒pCT△A1，得到嵌合质粒pSBR-CT△A1，转染E.coli，表达产物经ELISA检测，既有结合GM1神经节苷脂的能力，又保留了SBR的抗原性，经口免疫小鼠，诱导出高滴度的抗AgⅠ/Ⅱ的S-IgA和血清IgA，且持续3-6月。

　　3　嵌合基因疫苗

　　是指将多种编码抗原蛋白的基因通过基因重组技术，构建嵌合真核表达质粒，直接导入动物细胞，诱导保护性免疫。基因疫苗接种后，抗原在细胞内的表达与病原体自然感染过程相似，能以更天然的构象递呈^[13]。目前嵌合基因疫苗在肝炎疫苗中已取得成功。如国内王炯^[14]采用带有HAV、HBV主要抗原表位基因的真核表达质粒，直接接种小鼠2-3次后，产生了针对HAV、HBV的抗体应答反应。当前虽没有防龋嵌合基因疫苗报道，但变链菌作为重要致龋菌，其主要毒力因子AgⅠ/Ⅱ和GTFs的基因spap和gtfs已被成功克隆，核苷酸和氨基酸序列序列已基本清楚，对蛋白质分子中各功能区及相互作用的了解日臻完善^[15]，以及对抗原表位筛选的成功，为研制防龋嵌合基因免疫提供了依据^[16，17]。

　　综上，因龋病是发生于口腔的特殊疾病，只有在对共同粘膜免疫系统机理、变链菌各毒力因子、及疫苗的安全性和有效性深入了解的基础上，嵌合防龋疫苗才能最终成功。

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(1999-05-12收稿)

校对时间：99-12-08　21:46　杜育苗