角膜缘干细胞增殖分化调节机制的研究进展

国外医学眼科学分册 1998年 第22卷，第3期：135-139

山东省医学科学院眼科研究所

崔 彦　 综述　谢立信　 审校

　　摘要：角膜缘干细胞是一种独特类型的细胞，其增殖分化有特殊机制调节。对此机制进行研究，需先用一定方法分离纯化角膜缘干细胞，然后采用克隆培养及相应的增殖分化评价方法进行评价。角膜缘干细胞增殖分化受局部微环境调节。血清、各种细胞因子及基质细胞对其增殖分化均有调节作用。

　　角膜缘干细胞（stem cell,SC）是位于角膜缘基底上皮层的特殊细胞，其生理生化特点已基本研究清楚^[1-3]。临床上，利用干细胞理论可解释诸如先天性无虹膜、眼化学烧伤等疾病的发病机制^[4，5]。应用自体、异体角膜缘干细胞移植治疗严重的眼表疾病已取得了显著效果^[6-8]。但是，干细胞在何种状态下开始分裂？分化程度如何控制？即对干细胞增殖分化调控机制的研究刚刚起步，对此调控机制的研究有独特方法。现就对此研究方法及最新研究进展综述如下：

　　一、角膜缘干细胞分离与纯化

　　角膜缘干细胞存在于角膜缘上皮基底层^[9]，此处的基底细胞并非都是干细胞。所谓表皮增生单位（epidermal proliferate units.EPU），是由10-15层细胞构成，只是基底细胞能够增殖，而在一个EPU中有10-11个基底细胞，中间的一个是干细胞，其余的相当于短暂扩充细胞（transient amplifying cells.TAC）。在对干细胞增殖分化的研究中，需先采用特殊方法获得纯的干细胞，然后再通过培养，研究其增殖分化机制。对于干细胞的分离纯化方法已有不少尝试。

　　Tseng等^[10]观察到，鼠在系统应用5-氟尿嘧啶（5-FU）后骨髓细胞明显减少，而原始造血干细胞增多。这提示5-FU可减少快速增殖TAC细胞，而保留静态的干细胞。因角膜上皮可快速自我更新，并对5-FU毒性特别敏感，5-FU毒性选择作用于基底增殖细胞，可导致全部基底层以上细胞层的丧失，而使慢周期干细胞得以保留。据此，Tseng在兔结膜下注射5-FU20mg/眼，可选择性减少角膜TAC细胞，有效获得丰富的较纯的干细胞。

　　Kruse等^[11]研究表明，将整个角膜上皮及周围3mm范围的角膜角缘和结膜上皮取下后，用n-庚醇液环形擦试。处理时间不同，残留的细胞量不同。在处理120秒时，仅保留角膜缘上皮粘附，而角膜结膜上皮均被去除。可见，用此方法能获得较纯的干细胞。

　　kruse等^[12]通过消化方法以获得单个的干细胞而进行培养。在距离巩膜缘后2mm处剪下兔眼角巩膜片，去除内皮和虹膜。用10mm环钻取下角膜缘组织，用DispaseⅡ液消化3小时，去除松散的上皮层，再通过.01％trypsin和0.02EDTA在无钙的EM的二次消化10分钟，即可将细胞分离为单个。

　　另外，尚有人利用毛地黄皂苷选择性去除浅层角膜上皮，暴露基底细胞层^[13]。

　　总之，各种分离细胞方法均有效，研究过程中将它们有机地结合，可提高分离效率及纯度。

　　二、无血清单细胞克隆培养角膜缘干细胞及评价方法

　　对于角膜缘干细胞增殖分化调控机制的研究，多采用离体培养方法进行。角膜缘干细胞离体后培养，虽然在一定程度上改变其固有的生物学特性，但仍有一种有效的研究方法。以往的细胞培养均加入血清等天然培养成分^[11，14]，血清的生物效应早已证明，它含有多种促细胞生长因子、促粘附因子及其它活性物质等。添加血清虽有利于细胞生长，但不明成分也增多了，对分析实验结果增加了困难，尤其在对增殖分化调控的研究中，无法分析实验结果。针对这一问题，Kruse等^[5]最早提出角膜缘干细胞无血清单细胞克隆培养方法，并利用此方法，对角膜缘干细胞的增殖分化调控机制做了系统化的研究。这种无血清单细胞克隆培养基是在MCDB151基础培养基中加入胰岛素、转铁蛋白、氢化考的松、硒、钙、磷酸乙醇胺等。这种培养条件适合TAC细胞增殖，而干细胞在此培养条件下保持静态。可见，此培养方法可用来研究调节干细胞转化为TAC细胞的因子。

　　对于此种培养有其独特的增殖、分化评价方法^[12]。细胞增殖评价指标包括克隆形成系数（CFE）、克隆大小及溴脱氧尿苷（BrdU）标记法。CFE为评价能形成克隆的种植细胞的比例。克隆大小即每克隆的细胞数，克隆根据其大小分为以下三类：小克隆为细胞数小于10个，中克隆为细胞数介于11-20个，大克隆为细胞数大于20个。BrdU标记法可评价细胞增殖率及每个克隆增殖细胞的分布。BrdU标记指数为BrdU阳性细胞与每克隆细胞总数的比例。

　　细胞分化评价包括克隆形态的观察；细胞角蛋白单克隆抗体检测，如用AE-5检测角膜上皮表达的K3角蛋白^[16]；是否形成角质化套等。

　　三、角膜缘干细胞和分化调节机制

　　通过各种方法分离纯化角膜缘干细胞、采用无血清单细胞克隆培养方法，根据其特有的增殖分化评价标准对角膜缘干细胞增殖分化调节机制研究已取得较大进展。现将目前研究新进展总结如下：

　　（一）血清对角膜缘干细胞增殖分化调节

　　角膜缘上皮与血管化组织接近，其增殖分化受血清来源的因子的调控^[17]。利用无血清克隆培养基分别对周围角膜和角膜缘组织进行培养，其中加入1％小牛血清，周边角膜CFE（克隆形成系数）和克隆大小减少，而对角膜缘培养无影响，两种培养克隆形态、BrdU标记及AE-5染色均无差异。在培养基中加入10％或20％小牛血清后，CFE和克隆大小在角膜缘培养中增加，而周边角膜培养呈剂量依赖性减少。值得注意的是角膜缘培养出现大量独特类型克隆，表现为BrdU标记强，异质性且AE-5阴性，表明处于增殖未分化状态，这些克隆在以后培养中表现边连续生长。说明血清中含有因子，可刺激角膜缘的原始细胞即干细胞克隆增殖^[8]。且只有达一定浓度时，血清中的因子才能发挥刺激作用。

　　（二）视黄酸对角膜缘干细胞增殖分化调节

　　血清中含丰富的生长调控剂，包括促分裂原和生长抑制剂。视黄酸在血清中浓度10^-8M，视黄醇即维生素A，浓度为1～3×10^-6M。两者均为一皮细胞增殖分化的调节因子。研究表明，视黄酸对于未分化干细胞的分化具有选择作用。

　　在周边角膜上皮的克隆培养中，视黄酸剂量依赖性地减少克隆大小及BrdU标记指数，即抑制克隆增殖。因为周边角膜上皮仅含TAC细胞，所以此发现最初分离的TAC细胞增殖可被视黄酸剂量依赖性地抑制。

　　与周边角膜一样，角膜缘早期培养的克隆大小和BrdU标记指数被浓度10^-8M的视黄酸抑制。但与周边角膜培养不同，浓度为10^-8M的视黄酸选择性地允许角膜缘克隆在晚期连续增殖。角膜上皮对视黄酸的反应性与周边角膜上皮的不同说明角膜缘上皮含不同于TAC细胞的独特原始细胞，即干细胞。

　　连续的角膜缘和周边角膜上皮的克隆增殖，可导致角质化套的表达。因为正常兔角膜上皮不表达角质化套，因此角质化套表达为异常分化。加入浓度为10^-8M或10^-7M的视黄酸后可抑制角质化套的形成。说明视黄酸刺激正常终末分化，抑制异常分化。

　　视黄酸抑制细胞增殖，刺激分化的机制并不完全清楚。加入视黄酸后可诱导转化生长因子-β（TGF-β）以自分泌和旁分泌的方式产生。TGF-β可抑制角膜缘和角膜培养中的克隆增殖，刺激分化。因此，视黄酸的作用可能通过TGF-β实现。

　　（三）基质细胞对角膜缘干细胞增殖分化调节

　　一系列的研究已证明，骨髓中造血干细胞的增殖分化有极其微妙的调控机制，这种调节是在骨髓内局部微环境中进行运转的。在这种微环境中，基质或接触因子能够影响干细胞的作用。基质细胞有产生多种调节因子的潜力，同时又有多种细胞因子受体，能结合和聚集外来的因子于局部，造成不同因子的不同浓度分布区。 lowry等^[19]推测这种基质细胞表面的不同细胞因子的不同浓度分布区就是所谓“壁龛”（niches）结构，而分布于基质细胞表面的不同细胞因子即为固定因子（anchor factors）。事实上，没有固定的“壁龛”结构，因固定因子分布的浓度是多变的，其生成量和活性彼此制约，亦受外源性因子影响。与此相类似，角膜缘干细胞增殖分化调节是在细胞～间质和细胞～细胞水平发生的，而细胞因子在细胞间信息传递和调控过程中起细胞语言作用^[20]。因此，角膜缘细胞因子及其受体表达的研究对了解干细胞增殖分化调节机制具有极大的意义。

　　应用Northern杂交，逆转录PCR等技术，证明人角膜和角膜缘上皮与成纤维细胞间存在细胞因子网络^[21]，基于细胞因子及其受体的阳性表达方式将角膜和角膜缘上皮细胞因子分为以下4型^[21]。Ⅰ型：TGF-α、IL-β、PDGF-B（PDGF-BB）.。角膜、角膜缘上皮细胞均表达这些细胞因子，但其受体却主要表达于间质内的成纤维细胞。Ⅱ型：IGF-1、TGF-β₁、β₂、LIF（促中性粒细胞增多因子）、bFGF及其受体表达于上皮及成纤维细胞。其中FGFR-1和FGFR-2多表达于成纤维细胞，bFGF角膜表达多于角膜缘上皮表达。Ⅲ型：KGF（角质细胞生长因子）和肝细胞生长因子（HGF）仅由成纤维细胞表达，其相应受体却主要表达于上皮细胞。并且KGF及其受体在角膜缘表达更多。HGF及其受体在角膜表达更多。此三型构成了上皮-间质细胞因子交互作用网络。Ⅳ型：巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）和IL-8表达于上皮细胞、成纤维细胞，但此两种细胞均不表达其受体，而表达于免疫或炎性细胞。这实为一种潜在的旁分泌功能，即分泌细胞与靶细胞为不同细胞，可促进创伤愈合中的炎症反应。角膜及角膜缘区细胞因子表达是不同的，如EGFR和bFGF在角膜缘基底上皮无表达，而在角膜上皮表达极强。由TGF-α/EGFR、IL-1β/IL1-R、bFGF/FGFR-1介导的自分泌，即分泌细胞与靶细胞为同一细胞，角膜表达多于角膜缘表达。这提示此网络参与正常上皮生长和分化的调节。进一步研究表明，处于应激或损伤的上皮细胞正是通过成纤维细胞间接地、选择性地激活角膜缘上皮干细胞，发生增殖与分化，促进创伤愈合^[22]。

　　（四）细胞因子对角膜缘干细胞增殖分化调节

　　为保持角膜上皮在生理状态尤其是在应激状态下的稳定性，需要两个相互重叠和互相补充的调节系统。一是基质细胞与干细胞的密切接触，另一个是细胞因子。Kruse和Tseng^[23]详细比较了不同生长因子对角膜、角膜缘克隆生长和分化的调节程度，与含有胰岛素的基础培养基的对照相比得出，表皮生长因子（EGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、大量神经生长因子（NGF）对两种上皮均是有丝分裂原。

　　EGF是最早被发现的一种细胞因子。眼表滴EGF后前房中可检测到EGF^[24]，说明泪腺可能为房水中EGF的来源^[25，26]。EGF为重要的有丝分裂原，因为若培养基中缺少EGF，则角膜缘及角膜上皮培养的CFE（克隆形成系数）及克隆大小减少。说明EGF可促进角膜缘及周边角缘TAC细胞的增殖。据检测。角膜缘基底细胞含EGF受体量较中央角膜基底细胞高4-5倍，说明EGF受体协助保持角膜缘干细胞的未分化状态^[1]。

　　TGF-α是5.5KD单链多肽，培养人角膜上皮细胞能合成TGF-α mRNA并含有相当量的TGF-α蛋白^[24]。免疫组化染色法亦显示人角膜整个上皮层均含有TGF-α。TGF-α与EGF有40％序列同源，且结合于相同受体EGFR^[27]，EGFR在角膜和角膜缘成纤维细胞均有表达，源于泪液的EGF和上此来源的TGF-α^[21，28]均可调节附近成纤维细胞，进而调节干细胞的增殖分化以。目前已较清楚TGF-α、EGF均通过增加细胞内钙离子的流入而发挥调节作用。

　　TGF-β是一组有高度同源性的二聚体多肽，包括TGF-β_1～5。分子量均为25KD，具有重要的生长调节作用。TGF-β受体几乎存在于角膜所有细胞，TGF-β能调控细胞对其它细胞因子如PDGF、FGF、EGF的反应，借此可以确定这些细胞因子是兴奋性的还是抑制性的。TGF-β₁表现出在对照组和在EGF或成纤维细胞生长因子刺激培养中的抑制效果，其抑制作用与AE-5强染色对应，而EGF、成纤维细胞生长因子或神经生长因子的有丝分裂作用对应于AE-5阴性克隆。说明TGF-β₁抑制克隆增殖，促进分化的调节作用。

　　KGF（角质细胞生长因子）是一种源于成纤维细胞的上皮有丝分裂原^[29，30]，在体外及体内^[31，32]均可刺激角膜上皮细胞生长。IL-1β可选择性上调角膜缘成纤维细胞的KGF转录表达^[33]，并且角膜缘成纤维细胞表达KGF较角膜成纤维细胞多^[21]。以此可以解释角膜缘干细胞可在创伤愈合早期就可被激活。IL-1β～IL-1R调节轴选择作用于含干细胞的角膜缘区，调节上皮与间质的相互作用，间接导致干细胞的激活。

　　IL-1β对许多细胞因子均有上调作用，对此上调作用，不同细胞因子达到上调峰值的时间不同，不同部位的细胞因子上调峰值时间亦不同。如：HGF（肝细胞生长因子）在角膜缘成纤维细胞达到上调峰值时间为4小时，而角膜成纤维细胞则在24小时。说明角膜缘成纤维细胞对IL-1β反应迅速而活跃。

　　所有细胞因子和受体的上调均可被放线菌素D抑制，说明这种上调受控于转录水平。许多细胞因子上调节机制可能由某些原癌基因的诱导而间接介导^[22]。

　　许多生长调节细胞因子在控制上皮生长和分化中存在潜在交互作用。如IL-1β可通过IL-1β～IL-1R调节轴对许多细胞因子的作用进行调节。

　　角膜缘区细胞因子种类繁多，各种因子调节角膜缘干细胞增殖分化机制复杂，尚待进一步研究。

　　四、发展与展望

　　随着对角膜缘干细胞增殖分化调节机制的逐渐了解，对于各种眼表疾病的治疗将有将新的突破，包括新药物的开发及指导手术方法的改进等。比如，培养后角膜缘干细胞移植治疗眼表疾病已是目前国内外眼科界研究热点之一。

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校对时间：99-12-07　20:09　杜育苗