|
人脐血造血细胞及其应用的研究进展
国外医学妇幼保健分册1999年第10卷第3期
中国协和医科大学协和医院妇产科（100730）
童英 潘凌亚综述 杨秀玉审校
摘要 人脐血富含高质量的未成熟造血细胞，脐血造血细胞可长期冻存及体外扩增，在移植和转基因治疗方面与骨髓和外周血相比显示出其优势，具广阔的临床应用前景。本文就此方面做一简要综述。
主题词 1.胎儿血/细胞学 2.造血干细胞/生理学 3.造血干细胞 4. 基因疗法
自1989年发现脐血富含造血干祖细胞，可供造血细胞移植以来[1]，越来越多的研究表明脐血是除骨髓、外周血之外又一极具有潜力的造血干祖细胞来源，并较骨髓和外周血干祖细胞在移植和转基因治疗方面显示出其优越性。目前，脐血移植被用于治疗一些儿童良性和恶性疾病取得较好的效果，这种应用正从儿童向成人过渡，具广阔的临床应用前景。
1.脐血造血干祖细胞的特点
脐血造血细胞也具有骨髓造血细胞的一些特点：是一组异质性细胞群，由不同等级的造血细胞组成，包括造血干细胞、多向祖细胞、定向祖细胞。迄今为止尚无直接鉴定造血干祖细胞的方法，只能通过细胞表面抗原标志（如CD34、CD33、CD38、CD71、CD45RA、HLA-DR、Thy-1等）、高增殖潜能集落形成单位（HPP-CFU）、长期培养启动细胞（LTC-LC）、粒红巨核巨噬系集落形成单位（CFU-GEMM）等检测方法进行推测。其中细胞膜CD34抗原阳性是造血干祖细胞最具代表性的免疫表型特征，在其分化过程中CD34抗原的表达逐渐减弱至消失，成熟血细胞CD34抗原阴性。实际应用中常以此作为造血干祖细胞阳性筛选及体外扩增的依据。
脐血中CD34+细胞约占有核细胞的1%，略低于骨髓水平。但脐血中早期造血干祖细胞含量却与骨髓和外周血相当或更高[2]。在CD34+细胞群中，具CD38-、CC33-、Lin-、CD45RA-、HLA-DR-等膜标志的细胞代表较早期造血细胞，其与移植后骨髓长期造血功能的重建有关。在脐血中这些细胞的所占比例相对较高[3]。Cardoso等研究表明脐血中CD34+CD38-细胞群占CD34+细胞的4%，而骨髓则为1%[4]。与骨髓相比，脐血中CD34+CD38-细胞形成CFU-GEMM、粒巨噬系集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）的数量相当或更高，形成的集落也较大，显示有较强的生长潜力。可见，同等数量的CD34+细胞中早期造血细胞的数量在脐血相对多于骨髓，满足同样体重造血重建所需的脐血量也可低于骨髓。Carow等用半固体培养发现脐血CFU-GEMM的再植入率、原代集落形成次级集落比例及集落大小均高于以往报道[5]。大多数次级集落源于CFU-GEMM，且CFU-GEMM次级集落形成数远大于骨髓。这些结果表明脐血中具有高质量的未成熟造血祖细胞，较骨髓更有利于造血功能的重建。
2.脐血造血干祖细胞的分离浓集及冻存
现在有多种方法可用于脐血造血细胞的分离浓集，如Ficoll、Percoll、甲基纤维素、明胶、羟乙基淀粉等。有研究发现明胶法造血祖细胞损失率最低，其集落形成细胞、CD34+细胞回收率分别达92%和86%[6]。用该法分离1份70 mL脐血能获得足以够成人移植所需的造血祖细胞。但目前广为应用的是利用抗CD34抗原的单克隆抗体进行分离纯化的免疫学方法，如免疫磁珠吸附法（MACS）、生物素-抗生物素亲和柱法、流式细胞仪（FAM）分选法。前两者具有纯度高、回收率高、分选快速等特点，可用于科研和临床。后者纯度高，但耗资耗时，仅用于科研。
随着造血细胞冷冻技术的发展及人们对脐血造血细胞认识的不断深入，脐血库在一些国家应运而生。Galmes等研究表明二甲基亚砜（DMSO）浓度从5%至10%，冻存的造血祖细胞都有最好的恢复和成活率[7]。由于DMSO有一定的毒性，推荐用5%DMSO冻存造血祖细胞。采用程序降温和rhGM-CSF预孵复温的方法可提高脐血造血细胞的集落产率。造血细胞冷冻受伤发生在冷冻和复温过程中，与保存时间不成正比。
Broxemeyer等低温冻存脐血达10年之久，其单核细胞的恢复平均为88%，CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM的恢复平均为74%～91%，在某些标本中达100%[8]。这些研究为脐血造血细胞的长期保存奠定了基础，为临床应用提供了方便。
3.脐血造血干祖细胞的体外扩增
重建造血要求CD34+细胞和CFU-GM分别达到＞2×106/kg和＞2×105/kg。尽管已有使用未经扩增的脐血造血细胞移植成人的成功报道，但因单份脐血所含造血细胞数量有限，主要用于儿童。进行体外扩增可扩大脐血应用范围。目前脐血造血细胞体外扩增的主要方法有如下方面。
3.1细胞因子的联合应用
大部分研究表明，不含造血因子的普通培养液几乎无扩增造血细胞的作用。在培养液中加入细胞因子进行扩增，细胞总数可增加数百倍至数千倍，祖细胞数扩增10倍至100倍。细胞因子IL-1、IL-3、SCF、EPO、FL等主要作用于较早期的多能造血祖细胞，IL-6、GM-CSF、G-CSF、M-CSF等主要作用于较晚期的定向造血祖细胞。不同细胞因子组合可产生不同的扩增效应。Mayani等对脐血CD34+、CD45RAlo、CD71lo细胞进行研究，结果显示细胞因子SCF、IL-3、M-CSF、G-CSF、EPO的某些特殊组合可致祖细胞数明显扩增，细胞数增加103倍以上，BFU-E扩增55倍，CFU-C扩增70倍，并影响其增生及分化形式[9]。Ohmizono等研究表明，TPO在SCF+IL-3或FL+IL-3存在的情况下能显著增加脐血定向祖细胞的扩增效率。细胞因子SCF+IL-3+TPO+IL-6或IL-11能最大限度刺激定向祖细胞的扩增，CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMM分别扩增197倍（第14天）、60倍（第7天）、51倍（第14天），没有IL-3其它因子组合不能有效扩增定向祖细胞[10]。这表明IL-3在SCF或FL存在情况下是促进人造血祖细胞扩增的关键因子。
3.2骨髓基质细胞
由成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞、网状细胞形成的人骨髓基质细胞层可产生细胞外基质和各种细胞因子。其对造血细胞有支持和扩增作用。Koller等采用基质细胞支持培养进行扩增，细胞数、CFU-GM、LTC-IC分别是液体培养的3.6倍、4.2倍、3.3倍,若多次更换培养介质及细胞因子可进一步提高扩增效应，总细胞数上升60%，LTC-IC增加170%[11]。Hao等用来源于脐血的CD34+CD38-细胞作为长期培养启动细胞（LTC-IC），在基质培养中能持续产生CFU-GM达100天以上[12]。
3.3脐血浆
有研究表明脐血浆有扩增造血祖细胞的作用[13]。但单用脐血浆扩增的多向造血祖细胞数目少，若将脐血浆和细胞因子联合应用，可有效扩增造血祖细胞，而且脐血浆对脐血造血祖细胞的扩增强于对骨髓的扩增。推测脐血浆中含有促造血细胞增殖的因子。脐血浆还有增强次级集落形成的作用[5]。
3.4负调控因子
脐血干祖细胞通过自分泌TGF-β等负调控因子使绝大多数干祖细胞处于静止期，而生长因子SCF+IL-6+IL-3+G-CSF+EPO等均不能阻断TGF-β的抑制作用。在上述组合加入TGF-β反义寡聚脱氧核苷酸或抗TGF-β抗体能有效拮抗TGF-β的作用，改善脐血CD34+CD38-细胞的长期扩增潜力，产生CFU-GEMM、CFU-GM和BFU-E分别是骨髓的1、2、3倍[4]。Charbord等在因子中加入TNF-α可使脐血CD34+细胞形成CFU-GEMM的数目明显增加，而对骨髓祖细胞无影响。说明脐血和成人骨髓的造血干祖细胞在增殖和扩增潜力方面存在有功能差异。
尽管脐血造血干祖细胞体外扩增取得一定进展，但如何在扩增早期造血干祖细胞的同时减少其分化仍是当前研究的热闹课题，有待深入研究，找出最佳因子组合及适宜培养条件。
4 脐血的应用研究
4.1脐血移植
自1989年首例用同胞脐血干细胞移植治疗一位儿童Fanconi贫血获得成功，脐血移植在治疗儿童白血病、先天性免疫缺陷、遗传性代谢病方面发挥了显著疗效，并表明脐血中所含的造血干祖细胞是儿童造血功能重建的有效来源。可克服骨髓移植在临床应用的受限性，解决我国独生子女骨髓供者来源的问题。脐血的免疫学特征表明与成人血相比，脐血所含的淋巴细胞更为幼稚，抗原表达弱，脐血中其它免疫细胞和辅助细胞的功能也弱于成人中的同类细胞，因此在儿童脐血移植中，接受了同胞及非血缘供者脐血的患者，不论有核细胞表面的组织相容性抗原（HLA）相合与不相合，其移植物抗宿主病（GVHD）的发生率和严重性均低于异基因骨髓移植。目前脐血移植供者从HLA相合的同胞过渡到HLA不相合的无关供者，移植对象从儿童过渡到成人[15]。
4.2脐血造血干祖细胞作为基因治疗的靶细胞
基因治疗是将外源基因转入靶细胞，通过在患者体内表达来纠正或治疗疾病的过程。研究表明逆转录病毒及腺相关病毒介导的基因转移技术是转导遗传物质进入哺乳动物细胞的有效方法。造血干细胞在人体内分布广泛，具有自我更新，增殖分化的能力，因而是最理想的靶细胞。自本世纪90年代初，脐血造血细胞作为目的基因转染的靶细胞成功以来，脐血移植用于基因治疗也日益受到重视。Kohn等将人腺苷脱氨酶（ADA）基因转入脐血CD34+细胞，输给3例腺苷脱氨酶缺陷患儿，治疗成功[16]。另外有用多药耐药基因（mdrl）转染造血细胞的研究。用mdrl基因转染造血细胞对骨髓进行保护性基因治疗，可加大化疗药物剂量，将对肿瘤的治疗产生重要的推动作用。Bertolini等将mdrl基因用逆转录病毒导入脐血造血干祖细胞，转导后2周，CD34+细胞中17%～25%的细胞表达mdrl基因产物Pgp170，并且在脐血的转导效率高于骨髓，提示脐血造血干祖细胞具有外源基因导入率高，表达稳定的特点[17]。逆转录病毒转染要求靶细胞必须处于增殖期，而造血干祖细胞大多处于静止期。因而还存在转染效率低及不能长期稳定表达的问题。有研究表明采用细胞因子预刺激，低剂量细胞因子持续灌注培养，骨髓基质层纤维结合素离心及体外长期培养等方法，可提高转导效率[18，19]。
Takiyama等对3例Gaucher病人的脐血及外周血CD34+细胞进行葡萄糖脑苷酯酶基因转染研究，表明用细胞因子SCF+IL-3+IL-6预刺激16小时可获得有效转导[18]。用骨髓基质层和纤维结合素培养分别使转导效率提高至36%和44%，离心2小时达83%，离心结合在含有细胞因子的体外长期培养中转染，可获得100%的转导效率。总的说来，目前脐血造血细胞基因治疗的研究尚处于初期阶段，相信随着研究的深入，基因疗法有望为临床治疗开辟更加广阔的途径。
5.结束语
人脐血来源丰富，采集方便，对供者无伤害，富含幼稚的造血干祖细胞，其病毒感染率低，无肿瘤细胞污染，造血细胞移植GVHD发生率低，基因转导效率高等诸多优点，使脐血成为造血细胞移植及基因治疗的又一重要来源。
主要参考文献
[1] Mayani H,Lansdorp PM.Setm Cells,1998;16:153～165
[2]Wang Jean C Y,Doedens M,Dick JE.Blood,1997;89:3919～3924
[3]Almici C,Carlo Stella C,Wagner JE,et al.Leukemia,1997;11:2143～2149
[4]Cardoso AA,Li ML,Batard P,et al.Proc Natl Acad Sai uSA,1993;90:8707～8711
[5]Carow CE,Hango G,Broxmeyer HE.Blood,1993;81:942～949
[6]Denning Kendall P,Donaldson C,Nicol A,et al.Exp hematol,1996;24:1394～1401
[7]Galmes A,Besalduch J,Bargay J,et al.Transfusion,1996;36:794～797
[8]Broxemeyer HE,Cllper S.Clin Exp Immunol,1997;107(supple):45～53
[9]Mayani H,Dragowska W,Landorp PM.Blood,1993;81:3252～3258
[10]Ohmizono Y,Sakabe H,Kimura T,et al.Leukemia,1997;11:524～530
[11]Koller MR,Palsson MA,ManchelL,et al.Blood,1995;86:1784～1793
[12]Hao QL,Thiemann FT,Petersen D.Blood,1996;88:3306～3313
[13]Bertolini F,Lazaari L,Lauri E,et al.BMT,1994;14:347
[14]Charbord P,Newton I,Villat L,et al.Br J Heamatol,1996;94:449～454
[15]Wagner JE,Rosenthal J,Sweetman R,et al.Blood,1996;88:795～802
[16]Kohn DB,Weinberg KI,Nolta JA,et al.Nature Medicine,1995;10:1～7
[17]Bertolini F,Demonte L,Corsini C,et al.Br J hematol,1994;88:318～324
[18]Takiyama N,Mohney T,Swaney W,et al.Eur J Haematol,1998;61:1～6
[19]Bertolini F,Battaglia M,Corsini C,et al.Cancer research,1996;56:2566～2572
校对时间：99-12-09 白艳萍
|
