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CNTF和NGF在损伤后变性神经组织中的表达与分布
中华显微外科杂志 1998年第2期第21卷 基础研究
作者：顾晓松 严志强 范明 曹铮 张沛云 谭湘陵
单位：226001 江苏南通市，南通医学院神经科学研究所(顾晓松，严志强，曹铮，张沛云，谭湘陵)；北京军事医学科学院(范明)
关键词： 神经退行性变；神经再生；睫状节神经营养因子；神经生长因子
【摘要】 目的：揭示睫状节神经营养因子（CNTF），神经生长因子（NGF）在损伤后变性神经组织中的表达与分布。方法：以5例成人正中神经切割伤后2～3个月的神经为材料，取损伤处的近、远侧端，冰冻切片，用特异性抗CNTF、抗NGF抗体免疫化学反应，ABC系统显色。计算机图象处理技术定量测量阳性免疫反应强度与面积，对照组采用正常正中神经。结果：在神经损伤后的近、远侧端中的CNTF含量明显高于正常组，CNTF位于增生活跃的雪旺细胞内。NGF在近、远侧端中的含量均高于正常组，NGF主要分布在部分神经纤维的轴索中。结论：CNTF与NGF在切割伤后的神经远侧端发生退行性变化的神经组织中仍可表达，呈向上调节趋势。通过神经趋化因子的表达，为神经再生与功能修复提供合适的微环境。
THE EXPRESSION AND DISTRIBUTION OF CNTF AND NGF IN DEGENERATING NERVE AFTER LESION Gu Xiaosong，Yan Zhiqiang，Fan Ming，et al. Institute of Neuroscience.Nantong Medical College.Nantong 226001
【ABSTRACT】 Objective：To study the expression and distribution of CNTF and NGF in degenerating nerve.Methods：Both proximal and distal stumps of transected median nerve from 5 cases as well as normal median nerve，were fixed and sectioned.The sections were separately reacted with CNTF and NGF antibodies，and visualized by ABC method.The area and content of positive-immunoreactivity were measured by computer image processing system.Results：The area and content of CNTF of distal and proximal stumps was higher than that of normal median nerve, CNTF-immunoreactivity was seen at the proliferating Schwann cells with strong immunostaining. NGF was found in axon area of the fibers of distal and proximal stumps and it could not be observed in Schwann cells.Conclusions：The up-regulation of the synthesis and secretion of CNTF and NGF in distal stumps with nerve degeneration strong indicated that the distal segment of an injured nerve provides a supportive environment for axonal regeneration by the expression of neurotrophic factors.
【KEY WORDS】 Nerve degeneration Regeneration CNTF NGF Human
近年来的研究资料提示，在中枢与周围神经系统的发育过程中，靶器官影响着轴索生长方向与选择支配，其可能的机制是靶源性的化学信号诱导着轴突的生长方向，这现象称为化学诱向性（Chemotropsim）。周围神经损伤后，其神经元的存活及轴突的再生有赖于多种神经营养因子。神经横切伤后，其远侧端发生溃变。在这一时期中，神经营养因子是否得以表达正是神经再生研究中的一个重要方面。本研究采用免疫组化方法探索CNTF 和NGF在神经再生过程及在损伤后变性神经组织中的表达与分布，为探讨神经再生的机制和神经营养因子在临床的应用提供科学依据。
材料与方法
5例成人的正中神经新鲜材料，均为神经干横断切割伤后2～3个月，术中分别取神经横断伤后近、远侧端(约10 mm）。立即投入4％多聚甲醛固定液中，4℃，72小时，冰冻切片，片厚25 μm。免疫组化步骤如下：第1步：兔抗CNTF 10 μg／ml，室温下12小时；第2步：生物素化羊抗兔IgG（Vector）室温下2小时；第3步：ABC复合物（Vector）室温下1小时；第4步：在DAB液中显色2～3分钟。阳性产物呈棕色。每步间用Tris缓冲液洗3次。每次3分钟。NGF免疫组化方法是，小鼠抗NGF 20 μg／ml（BMB），室温下1小时，APAAP 25 μg／ml（BMB）室温下1小时；快红（Fast Red）基质液呈色反应，室温下10 min，阳性产物呈红色〔1〕。
对照组采用1％BSA缓冲液代替初级抗体液。实验过程中将近、远侧端的神经切片与正常神经组织切片裱在同张载玻片上进行免疫组化反应，以保证各组间的实验条件相同。
计算机图像处理系统由AST386／25和PCVISION PLUS图像卡(美国Imaging技术公司)及专用软件组成。依据CNTF阳性免疫反应的图象灰度选择合适的灰度分割阈值，实现双阈值分割。得到样品的半灰度目标图象，以人机交互方式测定损伤神经近、远侧端及正常正中神经CNTF阳性免疫染色强度及面积。每组取5例，每例测2张切片。由计算机打印出所测CNTF阳性反应物相对含量的灰度值及面积。经统计学t检验各组之间CNTF相对含量是否存在差异。
结果
用免疫组化ABC技术显示正常神经组织，损伤神经近、远侧端均出现CNTF阳性反应。正常组织横断面观察，阳性反应产物为瘦月牙形围绕轴突及髓鞘，轴突及髓鞘呈阴性，阳性反应产物占据面积较小。纵切面观察，阳性反应产物呈线条状，位于神经纤维周边，阳性反应产物呈色较弱。在神经损伤后的近、远侧端均出现较强的CNTF免疫阳性反应，近侧端的阳性反应程度更强于远侧端。阳性反应产物位于部分有髓纤维周边的雪旺细胞胞浆内，这些细胞体积大，核深染呈增生活跃状态，神经横切面观察阳性反应产物则以胖月牙形或呈晕状环绕髓鞘，髓鞘及轴突呈阴性，但偶尔可见极度增生的雪旺氏细胞包绕的轴突，其轴区可见CNTF阳性反应产物，阳性免疫反应产物占据面积较小(图1，2)。纵切面观察阳性反应产物呈粗曲线状排列在神经纤维周边。图象定量分析结果表明：正常周围神经CNTF免疫反应灰度平均值157.23±9.767，阳性免疫反应产物面积为10.10±3.77 μm2；损伤神经近侧端免疫反应灰度平均值为131.77±11.31，面积为229.04±89.13μm2；损伤神经远侧端免疫反应灰度平均值144.30±11.43，面积为223.86±69.42μm2(图3，4），统计学t检验表明：正常神经与损伤后神经CNTF阳性反应产物的面积存在有显著性差异(P＜0.01）。
图1 再生正中神经近侧端横切面。ABC方法。阳性CNTF免疫反应产物位于部分雪旺细胞胞浆(▲)。标尺＝10μm。
图2 再生正中神经远侧端横切面。ABC方法。阳性CNTF免疫反应产物位于部分雪旺细胞胞浆(▲)。标尺＝10μm。
NGF的阳性反应产物出现在近、远侧端的部分纤维中。高倍镜下见分布在轴区。而在雪旺氏细胞中尚未能见到NGF阳性反应产物。NGF阳性反应的强度在近、远侧端实验组中的差异并不显著。但近、远侧端组中的NGF阳性反应强度明显高于正常组。
讨论
CNTF在周围神经主要位于形成髓鞘的雪旺氏细胞胞浆内。新近研究表明， CNTF于生后亦见表达，其含量随着神经的生后发育而有所变化，以1个月龄鼠最高，2个月龄次之，3个月龄最低〔2～4〕。周围神经损伤导致Wallerian变性，引起雪旺细胞功能改变，使之从维持髓鞘结构及轴突完整性转变为再生支持细胞。Sendtner及Smith等研究显示，在损伤大鼠坐骨神经后的早期，先是损伤处远侧端的CNTFmRNA然后是CNTF蛋白质的表达呈进行性下降，这种下降是以离心方式向远侧端进行的。而在近侧端CNTF的表达只有轻度下降〔5，6〕。在神经再生过程中，CNTF的表达则呈逐渐上升趋势，到第60天，已达到或超过正常水平。本研究发现在人神经损伤后2个半月的标本中，不论是近侧端还是远侧端，CNTF免疫阳性染色强度明显强于正常神经，尤其反应面积远远大于正常神经，这提示相对于一个雪旺细胞而言，损伤神经CNTF的表达要明显高于正常神经。CNTF呈强阳性反应，这表明雪旺细胞增生活跃和CNTF含量增加(呈向上调节)是与神经纤维的再生同步的。进而发现，神经断裂后的远侧端仍可测得CNTF的表达，而且阳性反应产物明显强于正常组。这一结果提示神经损伤后，导致了不仅仅是在组织病理学方面的Wallerian氏溃变，而是一个复杂的细胞学和生物化学的对损伤与再生反应性调控过程，特别是在蛋白质表达方面发生着明显的变化，如有些因子在正常情况下不表达或低表达，当损伤刺激后即处于高表达状态〔7〕，在远侧端发生退行性变的神经组织中，通过产生CNTF、NGF等因子为支持轴突再生，重新建立轴突与雪旺细胞的联系，以及对靶区的再支配，提供合适的环境。
灰度值
正常N 157.23±9.767
近侧端 131.77±11.31
远侧端 144.30±11.43
3 CNTF阳性免疫
面积(μm2)
正常N 10.10±3.77近侧端
229.02±89.13远侧端
223.86±69.42
4 CNTF阳性免疫反
反应产物灰度值应产物面积（μm2)
NGF在远、近侧端中均可表达，这提示NGF可能由神经细胞胞体合成后，向外周输送或由轴突衍生的靶器官部位的某种细胞合成后向心性输送。显而易见，CNTF与NGF在正常神经组织中处于不表达或低表达的状态，因子含量很低。当神经损伤之后的再生时期，尽管远侧端已发生退行性变，CNTF与NGF的表达仍可明显高于正常状态。这一现象提示：远侧端中的CNTF与NGF在神经再生与修复过程中起着重要作用。若在治疗神经系统疾病和神经损伤病例中，使局部和远侧端中CNTF和NGF表达增强或添加CNTF和NGF，可为神经再生，为提高神经生长速度创造良好的条件。
本文受国家杰出青年科学基金资助
参考文献
1 Cordell J，Falini B，Erber WN，et al. Immunoenzymatic labeling of anti-monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal antialkaline （APAAPcomplexes）.J Histochem Cytochem，1984，32：219-225．
2 Ip NY，McClain J，Barrezueta NX，et al.The α component of the CNTF receptor is required for signaling and defines potential CNTF targets in the adult and during development.Neuron，1993，10：89-97．
3 严志强，曹铮，顾晓松，等.睫状神经节神经营养因子在大鼠坐骨神经生后发育中的表达——免疫组织化学研究.解剖学报，1995，26：19-23
4 Dobrea GM，Unnertall JR，Rao MS.The expression of CNTF message and immunoreactivity in the central and peripheral nerve system of the rat.Develop Brain Res，1992，66：209-215．
5 SmithGM，Rabinovsky ED，MCmanaman JL，et al. Temporal and spatial expression of ciliary neurotrophic factor after peripheral nerve injury.Exp Neurol，1993，121：239-245．
6 Sendtner M，Stockli KA，Thoene H.Synthesis and location of ciliary neurotrophic factor in the sciatic nerve of the adult rat after lesion and during regeneration.J Cell Biol，1992，118：139-143.
7 Xiaosong Gu，PK Thomas，RHM King. Chemotro-pism in nerve regeneration studied in tissue culture.J Anat，1995，186：153-163.
(收稿：1997-05-14，修回：1997-09-04)
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