用“乒乓效应”和32℃培养提高重组逆转录病毒滴度

中华血液学杂志 1998年第1期第19卷 方法介绍

作者：尹芳　伍柏松　刘启发　伍志坚　郑维扬　周淑芸

单位：510515　广州，第一军医大学南方医院

　　逆转录病毒载体是目前基因治疗研究中最常用的外源基因转移工具。常规方法制备的重组逆转录病毒滴度较低，不能满足转染效率的需要。我们将逆转录病毒载体质粒转染混合培养的两种包装细胞PA317和GPE86，并在32℃条件下培养产病毒细胞，获得了比常规条件下滴度高一个数量级的重组逆转录病毒，现报道如下。

材料和方法

　　1　质粒和细胞株　包装细胞PA317、GPE86，NIH/3T3细胞及逆转录病毒载体质粒pLNCX、pLNC iL-2，均为美国南加州大学儿童医院周辰博士惠赠。

　　2　主要试剂　脂质体转染剂Lipofectin、筛选用药物G418、细胞培养基DMEM均购自生命技术公司。

　　3　细胞培养条件　PA317、GPE86和NIH/3T3细胞在37℃、5%CO₂、含10%胎牛血清和100U/L青、链霉素的DMEM中生长。

　　4　产病毒细胞株的获得　用Lipofectin将pLNCX、pLNC iL-2分别导入包装细胞PA317中，待产生G418抗性的细胞克隆后，随机挑取8个细胞克隆，分别进行扩大培养。用改良方法则将pLNCX、pLNC iL-2分别导入混合培养的包装细胞PA317和GPE86中。待产生G418抗性的细胞克隆后，随机挑取15个细胞克隆，分别进行扩大培养。

　　5　聚合酶链反应(PCR)鉴定混合细胞克隆中的PA317细胞克隆　获得的15个克隆细胞分别扩大培养后，提取细胞DNA，用PA317细胞包装蛋白基因env的引物^［1］进行PCR扩增。引物序列：

　　p₁　5?-ACCTGGAGATCACCAACC-3?；

　　p₂　5?-TACTTTGGAGAGGTCGTAGC-3′。

　　pCR条件参照文献［1］。出现411bp条带的为PA317细胞，否则为GPE86细胞。

　　6　病毒上清的收集

　　6.1　常规方法：产病毒的PA317细胞在培养瓶中长至80%～90%铺满后，换入新鲜DMEM全培养液，培养24小时后收集细胞培养上清，经0.45μm滤膜抽滤后，置－70℃保存备用。

　　6.2　改良方法：将细胞培养的温度改为32℃，其余与常规方法相同。

　　7　病毒滴度的测定　参照文献［2］进行，靶细胞为NIH/3T3细胞。

　　8　PCR检测有复制能力的逆转录病毒(RCR)　以重组病毒感染的NIH/3T3细胞DNA为模板，扩增env基因，条件同方法“5”。

结　　果

　　1　G418抗性的包装细胞克隆的形成　经G418选择培养14天，得到的抗性细胞克隆数目见表1。

表1　包装细胞经质粒DNA转染和G418选择后形成的克隆数目

　　2　PCR鉴定混合细胞克隆中的PA317细胞克隆　由于PA317细胞与GPE86细胞中env基因来源不同^［3］，因此，采用PA317的env引物进行PCR，只有PA317细胞才能出现411bp的env基因产物，GPE86则不能，以此可鉴别两种细胞。在随机挑取的15个pLNCX转染的混合细胞克隆中，经PCR证实有9个是PA317细胞，6个是GPE86细胞；在15个pLNC iL-2转染的混合细胞克隆中，有11个是PA317细胞，4个是GPE86细胞。

　　3　常规方法与混合培养法所得病毒滴度的比较　对G418抗性的PA317细胞进行扩大培养，收集上清并测滴度。结果(见表2)表明，无论是用pLNCX转染，还是用pLNC iL-2转染，经混合培养得到的PA317细胞病毒滴度明显高于单独培养PA317细胞所得到的病毒滴度(P＜0.01)。

　　4　PA317细胞在32℃培养与在37℃培养所得的病毒滴度比较　从pLNC iL-2转染混合培养细胞所得到的PA317细胞中选择最高滴度的6个克隆，分别置于37℃和32℃进行扩大培养，收集病毒上清。结果表明，包装细胞于32℃培养所产生的病毒滴度［(21.9±5.9)×10⁵cfu/ml］明显高于37℃培养下产生的病毒滴度［(8.3±0.9)×10⁵ cfu/ml］，P＜0.01。

　　5　有复制能力的逆转录病毒(RCR)的检测　6株高滴度克隆的PA317细胞产生的病毒转染NIH/3T3细胞，经PCR检测，未发生野生型病毒env基因的整合，说明得到的重组逆转录病毒上清中不含有复制能力的逆转录病毒(RCR)。

讨　　论

　　据报道^［4］，用含有单向性重组逆转录病毒的上清重复感染双向性包装细胞，或在单向性和双向性包装细胞之间互相反复进行感染(即“乒乓感染”)，均能使包装细胞中前病毒整合的拷贝数增加，提高病毒滴度。但是上述方法步骤较繁琐，费时较长。本研究采用逆转录病毒载体质粒转染混合培养的单向性包装细胞GPE86和双向性包装细胞PA317，在形成G418抗性克隆的过程中，PA317与GPE86细胞之间即可进行“乒乓感染”，2周内就能形成产病毒细胞株，而且获得的重组病毒滴度比单独培养PA317细胞获得的病毒滴度高约5～8倍。在此基础上，将细胞培养温度由37℃降至32℃，通过降低包装细胞代谢、提高病毒稳定性，使病毒的滴度又提高了2～3倍。总的效果是使重组病毒滴度提高了一个数量级以上。

　　应用逆转录病毒载体进行基因治疗的一个隐患是产生有复制能力的逆转录病毒(RCR)，其原因是缺陷型病毒载体通过同源重组恢复成野生型病毒。在本研究中，两种包装细胞共培养确有产生RCR的可能。但我们将共培养的时间严格控制在两周之内，降低同源重组的可能性，并采用PCR检测靶细胞中是否出现野生型病毒的env基因。结果表明，在筛选出的6株产病毒细胞中，无一产生RCR。

参 考 文 献

　　1　Morgan RA,Cornetta K,Anderson WF.Application of the polymerase chain reaction in retroviral-mediated gene transfer and the analysis of gene marked human TIL cells.Hum Gene Ther,1990,1:135-139.

　　2　Miller AD,Rossman GJ.Improved retroviral vectors for gene transfer and expression.Bio Techniques,1989,7:980-990.

　　3　Muenchau DD,Freeman SM,Cornetta K,et al.Analysis of retroviral pakaging lines for generation of replication-competent virus.Virology,1990,176:262-265.

　　4　高翠华,徐炎,韦启泽,等.高滴度产病毒PA317细胞的制备及基因转移效率的研究.基础医学与临床,1996,16:284-287.

表2　常规法和混合培养法所得重组PA317细胞产生的病毒滴度的比较

(收稿：1997-01-27　　修回：1997-05-08)

(校对：张吉贤)