透明质酸刺激因子对增生性瘢痕成纤维细胞生长增殖的影响

　　第四军医大学学报1999年第20卷第11期

杨力　鲁开化　王强　艾玉峰

　　摘　要　目的：了解兔源性透明质酸刺激因子（hyaluronic acid stimulating factor，HASF）对人增生性瘢痕成纤维细胞生长增殖的影响．方法：将HASF作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞，测定³H-TdR参入量、MTT反应A值及上清液中透明质酸（HA）的含量．结果：1×10^-3～1×10^-2 g/L HASF可剂量依赖性地使细胞³H-TdR参入量及MTT反应A值降低，HA含量明显增加（P＜0.01）．结论：兔源性HASF在体外能促进人增生性瘢痕成纤维细胞合成HA，对其生长增殖有明显的抑制作用；这种抑制作用可能是通过HASF刺激细胞合成HA来实现的．

　　关键词：透明质酸刺激因子　成纤维细胞

　　0　引言

　　透明质酸（HA）是影响胎儿伤口无瘢痕愈合的重要因素^［1，2］．透明质酸刺激因子(hyaluronic acid stimulating factor,HASF)能促进兔深Ⅱ度烧伤创面愈合及含HASF的多种动物血清能促进正常人皮肤成纤维细胞产生HA^［3，4］．尚未见HASF对人成纤维细胞生物学行为影响的报道．我们从胎兔血清及羊水中提纯HASF，并作用于增生性瘢痕成纤维细胞，就HASF对其生长增殖及HA合成的影响进行了初步研究．

　　1　材料和方法

　　1.1　实验动物　新西兰兔，体质量3 kg左右，孕龄20 d～25 d，由本校实验动物中心提供．

　　1.2　主要实验仪器与试剂　3550型自动酶联仪（美国Beckman），Ls6500型液体闪烁计数器(美国Beckman)，Sephadax g-25(中国科学院上海脑研究所)，ConA-Sepharose(瑞典 Pharmacia)，³H-TdR（上海核物理研究所），透明质酸放免测定盒（上海海军医学研究所）．

　　1.3　细胞　标本取材于增生性瘢痕组织6例，病程6 mo～2 a．供者年龄17岁～38岁，男4例，女2例，供区均为颈胸部．采用组织块法进行瘢痕组织的原代培养．用100 mL/L小牛血清DMEM作为传代培养液．实验采用第4代～10代细胞.

　　1.4　HASF的提取^［4］　孕兔20只，剖腹取羊水，分离胎兔血清，混匀过滤后经SephadexG-25层析，用0.02 mmol/L磷酸钠缓冲液作洗脱液，收集第1个蛋白峰．再经ConA-Sephrose亲和层析，当第1个蛋白峰流出后，用含0.1 mol/L α-D-甘露糖酐的同样缓冲液继续洗脱，收集第2个蛋白峰液体即得HASF溶液．比色法测得HASF溶液中蛋白质含量为0.63 g/L.

　　1.5　实验分组　设实验组（HASF分别1×10^-4 g/L，1×10^-3 g/L，1×10^-2 g/L，0.1 g/L），对照组及空白对照组（不含细胞）．

　　1.6　³H-TdR参入法　取96孔板，每孔中加入成纤维细胞5000个，置CO₂孵箱静养6 h，弃上清．按实验分组加入条件培养液，24 h后，每孔加入³H-TdR 37 kBq/μL，继续培养12 h，弃上清，胰酶消化细胞成单层，收集细胞于玻璃纤维纸上，液闪测定仪测定细胞³H-TdR参入量.

　　1.7　MTT反应定量法　取96孔板，加入细胞5000个/孔，静置培养24 h后，每孔加入MTT 2×10^-5 L(含MTT 5 g/L PBS)；继续培养4 h后弃上清，加入DMSO溶液2×10^-4 l，作用10 min，用自动酶联仪测定波长570 nm时的A值.

　　1.8　上清液中HA含量测定　取24孔板，每孔加入成纤维细胞2.5×10⁴个，静养6 h，弃上清，加入条件培养液．7 d后，收集上清液．用放免法测HA含量.

　　2　 结果

　　³H-TdR参入法和MTT反应定量法都表明，HASF对瘢痕成纤维细胞具有抑制生长增殖的作用（Tab1，2）．在一定范围内，随HASF浓度升高，生长抑制作用增强，存在着剂量效应关系．HASF超过1×10^-2 g/L浓度时，抑制效应不再随HASF浓度的增加而增加，具有饱和性．细胞培养上清液中HA含量测定结果表明，兔源性HASF也能刺激增生性瘢痕成纤维细胞合成HA．随着HASF浓度升高，HA含量也升高，具有明显的剂量依赖性（Tab3）．当HASF浓度增至0.1 g/L时，尽管HA含量有所增加，但与1×10^-2 g/L组相比，经统计学处理并不相关，说明HASF刺激细胞合成HA也具有饱和性．

表1　HASF对成纤维细胞³H-TdR参入值的影响

　　tab1　The influence of HASF on the　³H-TdR incorporation of the fibroblasts　(cpm/1 000细胞)

^bP＜0.01 vs control.

表2　HASF对成纤维细胞MTT反应A值的影响

　　tab2　The influence of HASF on the A value of the fibroblasts MTT reaction

^aP＜0.05 vs control,^bP＜0.01 vs control.

表3　培养液中透明质酸(HA)含量的变化

　　tab3　The change of HA content in the culture　（μg/L）

^bP＜0.01 vs control.

　　3　讨论

　　HA是胚胎创伤无瘢痕愈合的重要因素之一，它能在伤口部位形成一个无瘢痕愈合的许可环境^［5］．目前认为HA是通过与细胞膜表面受体结合发挥作用的．HASF是胚胎伤口HA合成的主要影响者，其产生来源及机制不详，目前尚无其氨基酸序列报道，也没有该蛋白质的标准品．Decker等^［4］已证实HASF是一种相对分子质量为150×10³、耐热，对酸碱敏感的糖蛋白，有关研究多数是按Decker所介绍方法提取，并以其在体外刺激成纤维细胞产生HA的量来检测所提HASF的活性．我们所提纯的兔源性HASF在体外也能剂量依赖性地刺激人增生性瘢痕成纤维细胞产生HA，既往未见类似的文献报道．当HASF超过一定浓度时，HA合成具有饱和性，我们分析这是由于HASF与细胞以某种未知方式的结合达到饱和，细胞对HASF刺激其合成HA的反应也达到饱和所致．外源性HA能抑制成纤维细胞的生长增殖．本实验结果证实，HASF对成纤维细胞的生长增殖具有剂量依赖性及饱和性．我们认为，当HASF刺激细胞所产生HA与细胞表面HA受体结合未达到饱和时，随HA合成的增加，细胞生长抑制效应也增加；当HA与细胞HA受体结合达到饱和时，继续增加HASF刺激细胞所产生的HA因没有更多受体与之结合，因而就不能产生有效细胞反应．因此，HASF对增生性瘢痕成纤维细胞生长增殖的抑制作用可能是通过HASF刺激细胞合成HA来实现的．

　　作者简介：杨　力，男，1964-09-24生，陕西洋县人，汉族．1997年第四军医大学毕业，获硕士学位．主治医师、讲师，发表论文7篇．电话:(029)3375305作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心，陕西 西安710033

　　参考文献

　　1 Pepallma RL，Krummel TM，Durham LA et al．Characterization and guantitation of wound matrix in the fetal rabbit．Matrix，1989;9（5）:224-230

　　2 Estes JM，Adzick NS，Harrison MR．Hyaluronste metabolism undergoes on ontogenic transition during fetal development: Implications for scar-free wound healing．J Pediatr Surg，1993;28(10):1227-1231

　　3 杨　勇，葛绳德．透明质酸刺激因子对深Ⅱ°烧伤创面瘢痕形成的影响．中华烧伤整形外科杂志，1995；11（50）:339-342

　　4 Decker M，Chiu ES，Dollbaum C et al．Hyaluronic acid stimulation activity in sera from the boving fetus and from breast cancer patients．Cancer res，1989;49(5):3499-3505

　　5 Longacker MT，Harrison MR，Longer JC et al．Studies in fetal wound healing:Ⅱ．a fetal enviroment accelerates fibroblast migration in vitro．J pediatr Surg，1989;24(8):793-798