PKD1，Polycystin与成人型多囊肾病

　　国外医学遗传学分册1999年第22卷第2期

　　上海第二医科大学附属瑞金医院肾脏科（上海200025）

　　石蓉综述姚建审校

　　提要 常染色体显性多囊肾病是最常见的遗传病之一，其中突变率最高的基因 pKD1被克隆后，该基因的蛋白产物 polycystin也已编码合成，1996年以来开展了初步的活体研究，在此基础上进一步提出本病发病机理的假说，及展望未来工作重点。

　　关键词：多囊肾；基因；膜蛋白

　　常染色体显性多囊肾病（ autosomal dominant polycystin kidney disease,ADPKD）又称成人型多囊肾病，是最常见的肾脏遗传病，发病率在人群中可高达1‰^[1]。其特征为渐进性的肾脏囊肿的形成与肾功能减弱，伴有广泛的肾外表现，大部分患者病情将发展至终末期肾衰^[2～4]，因此能否在遗传物质水平进行干扰或治疗，或退而求其次，延缓病情发展，探讨其发病机理是颇具现实意义的。

　　作为单基因遗传病， aDPKD具有遗传异质性，按目前研究至少可由3个独立位点上的基因突变引起。 pKD1定位于16p13.3^[5,6]，占总患者数的85%^[7]，临床表现也最典型； pKD2，位于4q13-23^[8,9]，约占10%～15%，临床表现较轻^[10]；第3个基因目前现仅有散见病例，尚未明确定位^[11,12]。本文拟就 pKD1及其基因产物 polycystin的研究现状作一综述。

　　一、基因与蛋白结构

　　自1985年， reeder通过 rFLP连锁分析将 pKD1定位于16p13.3，却由于该区域基因富集，表现为富含 cpG岛(CpG为基因5＇端的标志)，定位克隆只能将范围缩小到600kb左右^[13]。

　　之后近十年中，有关多囊肾的研究无突破性进展，直到1994年欧洲多囊肾协作组发现了一个特殊的葡萄牙患者家系^[6]，家族中同时有结节性硬化患者与多囊肾患者，引起人们感兴趣的是结节性硬化也属遗传性疾病而且其基因 tSC2定位正是上述基因富集区。经染色体检查等发现事实上在该病案中，16号染色体在16p13.3处断裂，其中 aDPKD患者发生与22号染色体的平衡易位，而结节性硬化患者则发生了非平衡易位，有断裂片段的丢失，人们就推测后者由于片段丢失失去了 tSC2基因，前者则由于平衡易位 tSC2基因未遭破坏，只是易位断裂点正好破坏了 pKD1。经分析证实断裂点确定破坏了一个基因，后来又在其它 aDPKD患者发现有该基因的突变，进一步证实此为 pKD1基因。

　　pKD1基因的结构具有其特殊性一除了3＇端大约20%的部分是单拷贝序列外，其余部分均在16p13.3至少有4个相同拷贝，从而为克隆该基因带来了困难。不过，世界各地的科学家不约而同绕开了这个问题^[14～16]，如1995年国际多囊肾协作组通过比较 cDNA与原始基因序列，成功组装了该 mRNA。现已基本表明 pKD1基因共跨越了52kb，包含46个外显子，转录成共14148bp的 mRNA，开放讯码框12912bp，据此翻译合成的蛋白质分子，取名 polycystin,国内也有称 pKD1蛋白，含4304个氨基酸，分子量约462000道尔顿。

　　迄今为止，多囊肾患者 pKD1基因突变的检出率仅10%～15%^[17]，除了近来有报道在重复区域检出7种突变^[18]，以往的记录则仅限于3＇端单拷贝区，共发现27种突变，类型计有缺失、移码、无义、错义等，也并未发现有所谓的脆性位点—只有一个位点的突变发现有超过1例，余均呈单发—如此提示我们，一则大部分突变主要位于上述重复区域内而目前尚难检测，突变可能遍及整个基因；二则 polycystin的多个结构部分均具有活性作用。

　　由于已明了 polycystin的氨基酸序列，人们对之进行了离体分析，发现 polycystin很大程度上是糖基化的，其 c端组成亲水区域，近来有报道存在一个螺旋卷曲结构区域（ coiled-coil domain）涉及与 pKD2基因产物 c端的特异性结合^[19]（相互关系与作用此处不再赘述），不过假想中的跨膜结构各家尚有争论， hughes等谓之为11跨膜单位^[16]，美国多囊肾协作组则报道为7跨膜单位^[14]，对于其组成的受体性质，也还尚无定论。而在 polycystin的 n端，人们找到了与一些已知胞外蛋白具同源性的系列结构域，这些假想中的结构包括：①两个亮氨酸富集的重复区（ lRRs）紧随在信号肽之后，它常涉及蛋白质之间的相互作用^[14]；②随后的 c-型植物凝集素域（ lectin），是结合碳水化合物的结构；③富含半胱氨酸的低密度脂蛋白 a域（ lDL-A），其功能是在 lDL受体相关蛋白中充当配体粘着区；④还有多达14拷贝的免疫球蛋白样单位，以及多个Ⅲ型纤维连接蛋白。 polycystin整个大分子与已知所有的蛋白质家族均无同源性，仅由其结构探讨，推测 polycystin与细胞间及细胞—基质间的相互作用密切相关。

　　二、活体研究

　　1996年以来，由于各类抗 polycystin抗体的成功制备，使人们有机会进一步了解研究其功能^[20～25]。

　　正常情况下， polycystin广泛表达于多种器官的上皮细胞组成跨膜结构，包括肾脏（胎儿与成人）、肝内胆道、胰腺、肠道、肺脏、睾丸、甚至皮肤^[21]。由此，不难解释 aDPKD的多器官受累性-虽然我们尚未了解到在 aDPKD患者中比如皮肤有何病理性改变。

　　polycystin在肾小管上皮的表达从孕20周即开即开始，经历了围产期的高峰，维持在一定水平直至4岁开始下降，在肝细胞和胆道上皮的表层也大约在4岁左右下降^[22]。在正常成人， polycystin的肾内表达仅限于皮质肾单位上皮细胞以及血管内皮细胞，在近髓肾单位，只有在发生了诱导损伤后， polycystin方会表达。在对表达 polycystin的细胞培养后还发现有趣的现象，即当促使细胞与细胞发生接触后， polycystin会趋向局限于细胞的外侧膜^[24]。

　　在 aDPKD患者中，所有囊性变区域的上皮 polycystin均呈阳性至强阳性^[21,23]，使我们推测本病的发生并非由于 polycystin的缺乏，而可能是 polycystin的异常高表达或本身即为异常的 polycystin的表达。由于涉及到基因的重复区域，目前制备的抗体均为抗寡肽抗体，并非针对整个生物大分子，因此对上述假设尚无定论。

　　三、发病机理的假说

　　由于 polycystin在正常情况下的表达多见于胚胎期与婴幼儿期，远高于正常成人，而人类在出生后肾实质细胞的凋亡与再生均表现为低水平，敦促人们考虑正常情况下 polycystin可能涉及调节小管上皮细胞的分化成熟^[20,25]，而病理状态下则存在一种反分化状态。已有形态学方面的证实囊性上皮确定存在幼稚表现，包括核质比增加，失去极性表现如基底面褶皱减少等，更早有报道其 na⁺/K^-ATP酶仍然如同胎儿时期分布于游离面，而非正常发育上皮的位于基底面^[26,27]。进一步有假说将 polycystin对小管分化的作用定位于终末步聚，则缘于研究发现急性肾损伤后再生的肾单位表达 polycystin上升，此中涉及的细胞不可能为原始的基质细胞，而必为经一定步聚分化后的静止细胞。

　　经上述假说可解释，当 pKD1基因突变时，受累细胞由于无法最终分化成熟而停滞于相对的不成熟状态，其增殖能力必然高于正常已分化细胞^[28,29]。已在对包括 sV40， c-myc， h-ras等原癌基因转基因动物的研究中发现均有大小囊肿性改变并可最终发展至尿毒症^[30,31]，提示细胞增殖参与囊肿生成之始，并有研究显示细胞增殖贯穿囊肿扩增始终。这些异常的增生细胞形成一个潜在的可积聚淮体的空间，在小球滤过液，囊壁上皮的分泌和前已述及的异常定位的 na⁺/K^-ATP酶等共同作用下，囊液逐渐累积，加之大部分囊肿对小至无机离子，大至如β2-微球蛋白均高度通透，囊肿可增大直至与源肾小管不再相连，此时囊液多来源自上皮过度的分泌液。

　　那么， polycystin究竟如何行使其调节功能，尚是一个未解之迷。比较经典的学说认为，在肾小管的正常发育中，小管上皮细胞与细胞外基质（ eCM）的相互作用极其重要，只有在正确的相互协调下，才能开始特异的基因表达：依次引起小管上皮细胞分化调节合成 eCM， eCM又能反过来调节组织的形态发育，限定成熟的小管基底膜，当小管 eCM成份的合成/分解缺陷，会改变基底膜和管壁的状态，有利于囊肿的形成和发展，基于 pKD1是一种包含多个胞外结构域的跨膜蛋白的事实，也已证实 pKD肾小管基底膜异常增厚， eCM中Ⅳ型胶原和 fN含量增高，蛋白多糖下降^[32]，因此有假说认为在正常情况下，就是由 polycystin介导肾小管上皮细胞与 eCM的相互作用来促成小管细胞的正常分化， aDPKD时异常的 polycystin使相互依赖相互作用的调节机制失控，从而 eCM成份异常，上皮细胞也分化不全，进一步的恶性循环促成病情发展。

　　不过， aKPKD作为一种显性遗传病，并非所有的肾单位均有囊性受累，各个患者之间的个体差异也相当明显^[33,34]，从而有学者提出“二次受累”的假说进行解释，即遗传因素仅使受累者发生易感倾向，只有在“二次”因素—在生殖细胞突变的基础上发生体细胞突变—作用下才会发病。参照已有的对细胞因子的研究，考虑所谓的“二次”因素可能就是包括 gF， cAMP等在内的细胞因子。已建立的动物模型与之还是较一致的：杂合子小鼠（ cy/+）出生后在近端小管的部分节段会有散发的囊肿发生发展，出生后几乎所有的肾单位节段均已受累，并可在4周时间内发展成尿毒症^[35]，对此的解释就是纯合子生来即已“二次受累”，而杂合子在出生后才受到“二次”因素作用，其概率是随机的。

　　四、问题与展望

　　虽然 pKD1基因已被克隆，基因产物 polycystin也已经得到一定研究，但是从根本上说由于重复序列的存在等原因，人们依然对本病知之甚少。

　　究竟发生在重复序列中的突变是怎样的，重复序列有无特殊意义？ polycystin作为一种复杂的生物大分子，到底有何种功能并如何行使其功能，它比通常起介导作用的粘附分子的分子量显然要大，两者之间还有何异同，有无关系？既然考虑多个结构域均有活性，它们分别起何作用？1997年以来，随着对 pKD2基因及其产物研究的深入，也对 polycystin的作用有了一点模糊的概念，但尚离明晰的地步很远。

　　作为一种疾病，我们总希望可以比较主动的进行处理，因此症前基因诊断很意义。但由于重复序列的存在，以及考虑突变可存在于整个基因，直接通过分析 pKD1基因突变来诊断存在一定的困难，在较长一段时间里可能仍然需要依赖基因连锁分析。已在 pKD1基因位点附近发现多个微卫星 dNA如、 aC2.5、 sM7、 kG8等，利用其多态性为遗传标志，通过 pCR法扩增，以取代繁复的 rFLP法，国内也有类似报道。

　　当症状诊断明确后，能否实施基因治疗？而若从上述“二次受累”假说出发，是否可以从抑制“二次”因素入手，给临床工作一点指导，并可反馈验证该假说的真实性，这还有很多工作要做。即使有了初步的症状，可以做哪些工作延缓病情发展？无论实验或临床工作依然是任重道远。

　　参考文献

　　1 Garcia Iglesias C et al.Am J kidney Dis,1983;2:630

　　2 Gabow PA.N Engl J med,1993;329:332

　　3 Bennett WM.Kidney int,1993;42(Suppl 42 ):S74

　　4 Milutinovic J et al.Q J med,1984;212:511

　　5 Reeders ST et al.Nature,1985;317:542

　　6 European Polycystin Kidney disease Consortium.Cell,1994;77:881

　　7 Peters DJM et al.Contrib nephrol,1992;97:128

　　8 Kimberling WJ et al.Genomics,1993;18:467

　　9 Peters DJM et al.Nature genet,1993;5:359

　　10 Torra R et al.J Am Soc nephrol,1996;7:2142

　　11 Daoust MC et al.Genomics,1995;25:733

　　12 De Almeida S et al.Hum genet,1995;96:83

　　13 Germino GG et al.Genomics,1992;13:144

　　14 The American PKD1 consortiumt.Hum Mol Genet,1995;4:575

　　15 International Polycystin kidney Disease Consortium.Cell,1995;81:289

　　16 Hughes J et al.Nat genet,1995;10:151

　　17 Peral B et al.Am J Hum genet,1996;58:86

　　18 Roelfsema JH et al.Am J Hum genet,1997;61:1044

　　19 Qian F et al.Nat genet,1997;16:179

　　20 Ward CJ et al.Proc Natl Acad sci USA,1996;93:1524

　　21Geng Let al.J Clin invest,1996;98:2674

　　22 Griffin MD et al.Proc Am Assoc polycystin,1996;108:185

　　23 Peters DJM et al.Lab invest,1996;75:221

　　24 Ibraghimov Beskrovnaya O et al.Proc Natl Acad Sci USA,1997;94:6397

　　25 Grantham JJ.Am J Kidney dis,1996;28:788

　　26 Wilson PD et al.Am J physiol,1991;260:F420

　　27 Wilson PD et al.Kidney int,1995;47:724

　　28 Grantham JJ ,et al.Kidney int,1987;31:1145

　　29 Cowley BD et al.J Am Soc nephrol,1991;1:1048

　　30 Kelley KA et al.J Am Soc nephrol,1991;2:84

　　31 Trudel M et al.Kidney int,1991;39:665

　　32 Wilson PD et al.Cell polycystin,1992;150:360

　　33 Grantham JJ Am J Kidney dis,1990;15:110

　　34 Qian F et al.J Am Soc nephrol,1995;6:707

　　35 Cowley BD et al.Kidney int,1993;43:522

(1998-05-06收稿，1998-10-09修回)

校对：姬颖