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胚胎肢芽内神经营养活性物质的提纯及其生物活性的研究
中华手外科杂志 1998年第4期第14卷 基础研究
作者：洪光祥 刘红光 王发斌 何善述
单位：洪光祥 刘红光 王发斌 430022 武汉,同济医科大学附属协和医院手外科；何善述 同济医科大学生化教研室
关键词： 胚胎；神经生长因子；神经元
【摘要】 目的 研究从胚胎肢芽内提取和纯化具有神经营养活性的物质。方法 剖腹取胚龄为10～15天的SD大鼠胚胎,将其肢芽连同基部剪下、剪碎。匀浆离心后取上清液超滤,分别收集大于10 000KD的组分和小于10 000KD的组分。然后将大于10 000KD的组分用高速蛋白液相层析系统分离,得5个蛋白组分,即＞300 000KD、21 0000KD、95 000KD、34 000KD和22 000KD组分。再将这5个组分连同小于10 000KD的组分,分别加至胚鼠背根神经节感觉神经元的培养基中,培养24小时后用MTT法测定神经元的活性。结果 95 000KD、34 000KD和22 000KD 3个组分对神经元有营养活性。其中22 000KD的活性较弱,95 000KD和34 000KD的活性较强。此外,22 000KD、34000KD和95 000KD合在一起的活性明显强于任何单一组分。结论 胚胎肢芽内含有较强的促进神经元活性的神经营养活性物质,为神经营养因子提供了新的来源。
Extracting and purification neurotropins from embryonic limb buds and study of their activity HONG Guangxiang,LIU Hongguang, WANG Fabin,et al. Department of Hand Surgery,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022
【Abstract】 Objective To extract and purify neurotropins from limb embryonic buds and study their bioactivity.Methods SD rats embryoes at the age of 10～15 days were obtained by cesarean section.Limb buds with their bases were cut off,and put in homogenizer for homogenating.After centrifugation, the supernate was ultrafiltrated and passed HPLC molcular column. The proteins in limb buds were then separately components of ＜10 000KD, 22 000KD, 34 000KD,95 000KD,210 000KDand ＞
300000KD. Each of them was seperately added into the medium of rat embryonic sensor neurons from dorsal root ganglia. After having been cultured for 24 hours, the neurons'surviving activity was examined by MTT method.Results The components of
22 000KD, 34 000KD and 95 000KD have neurotrophic activities,and the activity of component 22 000KD being weak， the other two are strong.In addition, the mixture of these three components has the highest activity.Conclusions Neurotrophic substances with high activity are present in limb buds,and limb buds may become a new source of neurotrophic factors (NTFs).
【Key words】 Embryo Nerve growth factors Neurons
自本世纪50年代发现神经生长因子(NGF)以来,探索神经营养活性物质的研究一直是周围神经学领域内的热点。迄今为止,虽然从多种神经靶器官和胶质细胞等处获得了多种神经营养因子［1,2］,而且取得了很大的进展,但仍不能使神经损伤后的功能恢复到满意程度。肢芽是周围神经发生的摇篮,其内必然含有多种神经活性成分,维持和促进周围神经的生长发育。我们在研究中也发现,胚胎肢芽的提取物对体外培养的神经元具有较强的神经营养活性［3］。为进一步探索从其内提取和纯化具有神经营养活性的物质,我们进行了下面的实验。
材料与方法
一、抽提大鼠胚胎上清液
剖腹取胚龄为10～15天的SD大鼠胚胎68只,切取其肢芽连同肢芽发出的胚胎基部,立即投入-196℃的液氮中迅速冷冻。充分剪碎后,按每克组织加入2ml(30mmol/L)的醋酸铵缓冲液进行匀浆,匀浆物先以6 000转/分的转速于4℃离心60分钟,然后取上清液在30 000转/分的转速下于4℃离心4小时,收集第2次所得的上清液。
二、分离纯化
将上清液用不同浓度的硫酸铵溶液进行分级沉淀,沉淀物经上述缓冲液溶解后,置于4℃冰箱中透析过夜。上Sephadex G-100柱(2.5cm×50.0cm),用0.01mol/L,pH 7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱,流速为0.01 L/小时。 洗脱后得三部分,收集第二部分用PM 10超滤,然后分别收集大于10000KD的组分和小于10 000KD的组分。再将大于10 000 KD的组分用高速蛋白液相层析系统(Parmacia)分离,洗脱液仍为上述PBS,流速为1ml/分。结果显示:相对分子量大于10 000KD的蛋白峰有5个,出峰时间分别为10.38分、16.86分、18.35分、22.78分和23.99分。与标准样蛋白出峰时间对照得出的相对分子量为＞300 000KD、210 000KD、95 000KD、34 000KD和22 000KD。用紫外分光测定其浓度分别为0.086 g/L、0.028 g/L、0.059 g/L、0.064 g/L和0.047 g/L, 小于10000KD组分的浓度为0.067 g/L。用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后,分装于无菌小瓶中,于-70℃保存备用。
三、神经营养活性分析
取胚龄为14天的SD大鼠胚胎28只,于手术显微镜下摘取其神经节,剔除外膜,剪碎后分别用0.25%的胰蛋白酶和0.01%的Ⅳ型胶原酶消化(37℃,5%CO2,饱和湿度)20分钟,吹打分散细胞,然后离心(1 000转/分,5分钟),细胞沉淀加Eagle培养基溶解成细胞悬液,过200目不锈钢网,用差速粘附法纯化神经元［2］。细胞计数并调整至50万个/ml,混匀后,吸取150 μl至96孔培养板,分别加入＞
300 000KD、210 000KD、95 000KD、34 000KD和22 000KD,＜10 000KD和95 000KD，34 000KD和 22 000KD的混合组分,依次分为8组,每组10孔,分6次进行实验。每次加样量为50 μl,蛋白含量每ml为10 μg、20μg、40 μg、80 μg、160 μg和320 μg;对照组加50 μl的PBS,培养24小时后用微量自动比色法［3（4,5 dimethly-thiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT］测定神经元的活性［4］,并进行t检验分析。
结 果
培养24小时后,用MTT法测得反映神经元活性的OD值见表1。
表1 MTT法测得反映神经元活性的OD值
| 加样量ng/ml |
＜10KDa |
22KDa |
34KDa |
95KDa |
210KDa |
＞300Kda |
22、34、95KDa |
PBS |
| 10 |
0.098±0.020 |
0.121±0.030 |
0.175±0.018 |
0.156±0.034 |
0.105±0.013 |
0.094±0.013 |
0.190±0.021 |
0.096±0.014 |
| P1＞0.05 |
P1＞0.05 |
P1＜0.01＞ |
P1＜0.01 |
P1＞0.05 |
P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
— |
| t1=0.07 |
t1=1.67 |
t1=7.37 |
t1=3.40 |
t1=0.69 |
t1=0.54 |
t1=8.21 |
— |
| P2＜0.01 |
P2＞0.05 |
P2＞0.05 |
— |
— |
— |
— |
— |
| t2=4.67 |
t2=1.25 |
t2=1.91 |
— |
— |
— |
— |
— |
| 20 |
0.101±0.012 |
0.144±0.027 |
0.243±0.027 |
0.192±0.020 |
0.092±0.011 |
0.106±0.016 |
0.241±0.026 |
0.100±0.017 |
| P1＞0.05 |
P1＜0.05 |
P1＜0.01＞ |
P1＜0.01 |
P1＞0.05 |
P1＜0.05 |
P1＜0.01 |
— |
| t1=0.12 |
t1=3.28 |
t1=10.71 |
t1=8.41 |
t1=0.83 |
t1=0.74 |
t1=10.91 |
— |
| — |
P2＜0.01 |
P2＞0.05 |
P2＜0.01 |
— |
— |
— |
— |
| — |
t2=5.80 |
t2=0.10 |
t2=3.39 |
— |
— |
— |
— |
| 40 |
0.103±0.019 |
0.157±0.035 |
0.278±0.034 |
0.245±0.028 |
0.099±0.013 |
0.112±0.011 |
0.300±0.027 |
0.102±0.015 |
| P1＞0.05 |
P1＜0.05 |
P1＜0.01＞ |
P1＜0.01 |
P1＞0.05 |
P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
— |
| t1=0.26 |
t1=3.25 |
t1=10.55 |
t1=9.98 |
t1=0.12 |
t1=1.66 |
t1=14.03 |
— |
| — |
P2＜0.01 |
P2＞0.05 |
P2＜0.05 |
— |
— |
— |
— |
| — |
t2=7.21 |
t2=1.16 |
t2=3.23 |
— |
— |
— |
— |
| 80 |
0.089±0.013 |
0.180±0.021 |
0.307±0.026 |
0.281±0.034 |
0.090±0.012 |
0.103±0.018 |
0.348±0.029 |
0.093±0.015 |
| P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
P1＜0.01＞ |
P1＜0.01 |
P1＞0.05 |
P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
— |
| t1=1.06 |
t1=5.09 |
t1=14.91 |
t1=10.70 |
t1=1.05 |
t1=0.25 |
t1=16.60 |
— |
| — |
P2＜0.01 |
P2＜0.05 |
P2＜0.05 |
— |
— |
— |
— |
| — |
t2=10.61 |
t2=2.36 |
t2=3.36 |
— |
— |
— |
— |
| 160 |
0.100±0.019 |
0.191±0.021 |
0.346±0.030 |
0.318±0.035 |
0.099±0.014 |
0.089±0.009 |
0.389±0.029 |
0.090±0.010 |
| P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
P1＜0.01＞ |
P1＜0.01 |
P1＞0.05 |
P1＞0.05 |
P1＞0.01 |
— |
| t1=0.04 |
t1=7.51 |
t1=15.98 |
t1=12.61 |
t1=0.12 |
t1=0.13 |
t1=19.20 |
— |
| — |
P2＜0.01 |
P2＜0.05 |
P2＜0.01 |
— |
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— |
— |
| — |
t2=12.29 |
t2=2.89 |
t2=3.39 |
— |
— |
— |
— |
| 320 |
0.104±0.019 |
0.193±0.018 |
0.345±0.026 |
0.303±0.025 |
0.095±0.016 |
0.100±0.017 |
0.359±0.033 |
0.095±0.013 |
| P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
P1＜0.01＞ |
P1＜0.01 |
P1＞0.05 |
P1＞0.05 |
P1＜0.01 |
— |
| t1=0.34 |
t1=8.06 |
t1=17.84 |
t1=15.08 |
t1=0.44 |
t1=0.02 |
t1=15.64 |
— |
| — |
P2＜0.01 |
P2＞0.05 |
P2＜0.05 |
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t2=9.55 |
t2=0.76 |
t2=3.01 |
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注:P1、t1为与PBS对照的P值、t值; P2、t2 为与
22 000、34 000、95 000KD混合组分对照的P值、t值
讨 论
胚胎学研究表明,周围神经的发育始自肢芽阶段,由脊髓基板和脊神经节内的神经元发出胞质突向肌节和皮节延伸,然后逐渐长入皮肤和肌肉,并进一步分化发育成熟。这充分说明肢芽内含有多种促进轴突生长,维持神经元存活的神经营养活性成分构成神经生长发育的微环境。有研究表明神经生长因子(NGF)和神经生长因子低亲和性受体(P 75 NGFR)的基因表达始自肢芽阶段［5］。Henderson等［6］的研究表明促进运动神经元存活的神经营养因子(GDNF)存在于肢芽内,而且它在肢芽内的表达比脑组织还要多［7］。另有研究认为肢芽内的糖蛋白(tenascin),以及免疫球蛋白样分子L 1,N-cAM,MAG,PO和细胞外基质糖蛋白(laminin)等对周围神经的生长发育起十分重要的作用
［8］。但目前国内外尚未见有从肢芽中提取这些活性物质来研究治疗周围神经损伤的报道。我们在多年来一直从事周围神经损伤研究的基础上,借鉴神经生长因子和雪旺细胞源性神经营养活性物质研究的经验［1，9］,设计了本实验。旨在用现代较为先进的分离纯化和鉴定神经营养活性因子的新方法,来探索从大鼠胚胎肢芽中提取和纯化具有较强神经营养活性的因子。
结果表明,从胚胎肢芽提取物中纯化出来的分子量为22 000KD、34 000KD和95 000KD的蛋白组分可以促进背根神经节感觉神经元的活性,而且这种活性在160 000μg/L的范围内表现最突出。除22 000KD的活性较弱外,95 000KD和34 000KD的活性都特别强。按照Walike［10］的研究,它们具有神经营养活性。此外,还发现22 000KD,34 000KD和95 000KD合在一起的活性明显强于上述任何单一组分。这可能是因为3个组分所起的作用及作用途径各不相同,合在一起就出现了活性叠加的原因,同时它们又是构成周围神经生长发育微环境的主要成分,当加进该神经元的培养基后,它们同样能形成维持神经元存活的微环境。其具体机制尚需进一步研究。
神经营养因子(NTFs)是维持神经元存活,促进其生长发育及轴突再生的重要因素。除NGF以外,近年来已从中枢神经系统和神经靶器官等处获取了多种神经营养因子,主要有脑源性神经营养因子(BNTF),睫状神经营养因子(CNTFs),骨骼肌源性神经营养因子(MNTF)和雪旺细胞源性神经营养因子等［1］。这些神经营养因子有着不同的作用范围和活性,有一些已经成为药品并应用于临床。本研究首次从大鼠胚胎肢芽中提取和纯化具有较强神经营养活性的因子,从而为获取神经营养因子增加了一种新的的来源,也必将为研究治疗神经损伤,提高神经再生的速度和质量开辟新的前景。至于每一组分的进一步纯化及其生物学活性的特点,有待于深入研究。
本课题为卫生部科研基金、湖北省自然科学基金资助项目
参考文献
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（收稿：1998-05-15 ）
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