恙虫病病原体分类学位置及我国实验诊断研究

　　中国人兽共患病杂志1999年第27卷第1期

于恩庶

　　 关键词：恙虫病　东方体 立克次体　实验诊断

　　1　恙虫病病原体的分类学位置

　　恙虫病病原体具有立克次体属许多共同的表型特征：例如，与革兰氏阴性杆菌接近，失去部分代谢功能，生存于脊椎动物和节肢动物体内的活细胞内寄生增殖，通过节肢动物传染人，引起发热和发疹。因此，长期以来列为立克次体属的一个种，称为恙虫病立克次体（Rickttsia tsuraugamushi）。但1978年以来，相续发现恙虫病立克次体与立克次体属其他立克次体种有许多不同的特征：

　　1.1　形态结构　1978年Silverman^［1］用电镜观察各种立克次体的超微结构，发现恙虫病立克次体的外膜，不同于其他立克次体，其胞壁外层明显厚于胞壁内层，而其他立克次体正相反，相差3倍多，见表1。

表1　各种立克次体胞壁内层和外层的差异

　　1.2　染色性　恙虫病立克次体用马氏染色为蓝色，其他立克次体染成红色。

　　1.3　对青霉素的抵抗性　很早就有人证明恙虫病立克次体对青霉素有很强的抵抗性，每ml100μg不能阻止恙虫病立克次体在E细胞内生长繁殖，电镜检查这种培养物内的立克次体没有任何超微结构的改变。

　　1.4　化学分析　许多学者都证明各种立克次体均含有脂多糖，唯独恙虫病立克次体没有。Amano等（1987）^［2］对4种立克次体进行了分析，各种立克次体全细胞的蛋白含量为48％～57％，没有明显差别，而中性糖、庚糖和KDO则有明显差别，恙虫病立克次体的中性糖含量高于其他立克次体，但庚糖和KDO非常少，每mg小于2nmol。胞壁酸和肽聚糖的含量也少于3nmol/mg或检不出，为其他立克次体的1/8以下，见表2。胞壁酸、葡萄糖胺、庚糖和KDO是脂多糖和肽聚糖的结构成分。它们的缺少表明恙虫病立克次体的化学成分，不同于其他立克次体，这在立克次体分类上有重要意义。

表2　立克次体全细胞的化学分析

　　 单位：nmol/mg

　　1.5　SDS-PAGE分析蛋白成分　恙虫病立克次体有30多条多肽带，包括80、54～58、46、43、39、35、28和25kDa等大蛋白，其中最丰富的蛋白是位于细胞表面的一种54～56kDa蛋白（标定为56kDa蛋白）。免疫印迹试验证明这些多肽有抗原活性。56kDa多肽是型特异的，25、28和56kDa三种多肽是热修饰蛋白。其他各种立克次体表面为150～180、110～130、49、32、27.5和16.5～17.5kDa蛋白，完全不同于恙虫病立克次体^［3～6］。

　　1.6　16SrRNA序列分析　恙虫病立克次体在种族分类树上的位置，远离立克次体属其他成员。恙虫病立克次体各型之间的同源水平在98.5％以上，其他立克次体各种之间的同源水平在98.1％以上，恙虫病立克次体与其他立克次体间的同源水平在90.0％～90.6％，与埃里克体和巴通氏体间的同源水平为81％～82.9％。恙虫病立克次体与立克次体属其他种间的进化距离，几乎等于立克次体目的其他属间的距离^［7］。

　　1.7　用脉冲凝胶电泳（PFGE）测定斑疹伤寒和斑点热立克次体DNA染色体的大小约为1200kbp（Poux等1993）。而恙虫病立克次体则为一种2400～2700kbp的环状染色体，约为其他立克次体的2倍^［8］。

　　1.8　1990年Stoven等^［9］克隆了编码恙虫病立克次体热敏性蛋白的基因（Sta58kDa主要抗原基因）并测序，推断出49％的氨基酸序列与热敏性蛋白60kDa基因同种物相似，用多克隆和单克隆抗体进行蛋白免疫印迹试验进行比较，Sta58与热敏性蛋白的关系，发现Sta58在抗原上是独特的，与斑疹伤寒立克次体的热敏性蛋白60完全不同。因此，认为恙虫病立克次体构成了独立于立克次体属之外的独立谱系。

　　以上研究证明恙虫病立克次体与立克次体属其它成员，在表型和种类分类学上均有明显差别，应成立一个新属^［10］。恙虫病立克次体早在1930年由长与氏命名为东方立克次体，次年由绪方命名为恙虫病立克次体，加上恙虫病主要分布于亚洲东部，并为纪念这两位科学家，将这个新属命名为东方体属（Orientia），种为恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi）。见图1。

图1　恙虫病东方体在立克次体目的种族发生位置

　　本属的特征如下：

　　菌体短杆状，直径0.5～0.8μm，长度1.2～3.0μm，革兰氏阴性，能为Giemsa和Giemenez法染色，专性细胞寄生，菌体由非常柔软的细胞壁和细胞膜包围，细胞壁不含有胞壁酸、葡萄糖胺、乙-酮基-3-脱氧辛酸和羟基脂肪酸，这表明缺乏肽糖和脂多糖。电镜所见细胞壁外小叶明显厚于内小叶，没有鞭毛和内孢子，也没有粘液层。被吞噬进入细胞浆内寄生繁殖。菌体周围有电子透明晕带。从宿主细胞释放出来，类似病毒的芽生形。最丰富的结构蛋白分子量为54～58kDa,与25～28kDa蛋白同位于细胞表面，是热修蚀的。另外的主要蛋白是60kDa蛋白，位于细胞内，属于GroEl蛋白科。16SrRNA序列分析发现此属成员在种族分类学上聚集在一起，其同源性水平在98.5％以上（进化树距离少于0.015129），G+C含量为28.1～30.5mol％。本属现在只有一个种，但有抗原性变异，对小白鼠的毒力不同。本属仅在东半球发现。纤恙螨属的一些恙螨种为媒介，把东方体传播给人和脊椎动物，由雌成虫螨，经卵传递给子代。患者血清能凝集OXK抗原。

　　本Orientia属与立克次体属同归于立克次体科，两属比较见表3。根据16SrRNA序列分析在科内没有保留立克次体族的必要。本属现在只有一个种。

表3　东方体属与立克次体属的比较

　　2　恙虫病东方体的抗原分型

　　恙虫病东方体早期分为Gilliam karp和Kato三个原生型。以后在泰国又发现另外5个型：TA763、TA686、TA716、TA673和TH1817型。后来日本又报告3个新型^10～13］：（1）1984年Tamura在新泻分离到一个新型，定名Shimokoshi型。（2）1986年Yamamloto在宫崎分离到一个新型，命名为Kawasaki型。（3）1990年在九洲分离到另一个新型，命名为Kuroki型。这3个新型与泰国的5个型之间的关系，缺少研究。此外，韩国报告另一个新型Broyong型。

　　　早期的抗原分型是根据补体结合试验和免疫荧光试验鉴定的，各型之间的交叉反应很普遍，见表4。根据抗体滴度高低来判定型别。有的两型的抗体滴度相差仅一个滴度，即判为两个型。有的很难区别，则作为混合型，可能出现错判。

表4　各型间免疫荧光试验的交叉反应^［1］

　　近年用型特异的单克隆抗体进行鉴定，则易于判定见表5。Gilliam.Karp和Kato 3个型株，经PAGE后，与该3型株单克隆抗体做免疫斑点试验，各区带反应性不同，54～56kDa区带各型间无交叉反应，其他区则出现不同的交叉反应，说明54～56kDa蛋白是型特异抗原。该区带的蛋白含有大量甘氨酸、丙氧酸、天门冬氨酸、谷氨酸及少量酪氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸。

表5　用单克隆抗体鉴别型别

　　 a)Antigens were prepared from infected L cell cultures.

　　b)Titers are expressed as the reciprocal of the highest antibody dilution.

　　c)Reciprocal of the lowest antibody dilution seted.

　　恙虫病东方体抗原特异性主要位于东方体表面的56kDa蛋白抗原性的不同而异。例如，Kuroki型株最主要多肽位于58kDa，稍高于其他东方体型株的54～56kDa。免疫印迹分析Gilliam、Kato、Shimokashi和Karoki 5个型株的豚鼠免疫血清与同株54～56kDa多肽出现明显反应，而与Kuroki型株抗原反应很弱，Kuroki免疫血清与Kuroki株58kDa多肽呈很强反应，而与其他型株的54～56kDa多肽呈很弱反应或无反应。东方体各个型株特异抗原54～58kDa的裂解模式，Kuroki型株在19～43kDa之间有8条带，其他型株有5条带，也明显不同。这指出恙虫病东方体株特异性抗原在分子结构上的差异^［11］。

　　用不同型株特异性单克隆抗体免疫荧光试验（IF）和限制性片段长度多肽分析（RFLP）PCR扩增56kDa蛋白基因，可将恙虫病东方体抗原型进一步分成数个亚型。对日本恙虫病患者和恙螨分离的35株恙虫病东方体鉴定结果，有4抗原型。用IF试验可将7株Gilliam型分为2个亚型，15株Kawasaki型分为4个亚型；如用RFLP分析，可将Karp型分成2个亚型，8株Kuroki型分为2个亚型。从上述结果可以看出：相同的型用不同的方法，可分成不同亚型见表6。

表6　从日本分离35株恙虫病东方体的抗原型和亚型

　　另方面，从台湾啮齿动物和恙螨分离的10株恙虫病东方体，用单克隆抗体免疫荧法，有9株鉴定为Karp型，1株为Gilliam型。用RFLP图谱分析，与日本的Gilliam株又有不同，可分为6个亚型^［14］。

　　以上结果指出，恙虫病东方体，不仅可分成若干抗原型，还可用免疫学方法和RFLP分析，分成不同亚型。

　　郭恒彬（1997）构建恙虫病东方体型特异抗原56kDa（Sta 56kDa）群，型特异引物，用PCR技术进行检测、分型，将群引物扩增物进行RFLP分析和热循环自动双向测序法，进行序列测定，证明我国江苏地区有Kawasaki型。但与供试的日本Kawasaki型株又有不同，属于不同的亚型^［15］。

　　3　恙虫病实验诊断新技术

　　3.1　恙虫病东方体弱毒株的分离与鉴定　恙虫病东方体的分离并不难，通常用小白鼠接种法很容易成功，但弱毒株的分离往往不易成功。有人提出用环磷酰胺处理小白鼠，降低其功能，以提高弱毒株分离的阳性率^［16］。但我们遇到一些弱毒株，即使用环磷酰胺处理，仍不能引起小白鼠发病，有的仅有轻度肉眼病变，脾稍大，再继续传代提高致病力，镜检也查不到病原体。但传代不死鼠却有免疫力，用已知强毒株攻击不死，而对照鼠则能规律地死亡，证明鼠体内仍有恙虫病东方体。郭恒彬等（1990）采用多次环磷酰胺和改良稀释液（SPG加磺胺嘧啶和琥珀酸）接种标本的小白鼠，并把握好小白鼠的传代时机，成功地从弱毒株流行区的病人、鼠和恙螨分离出恙虫病弱毒株^［17］。

　　弱毒株分离的另一个有效方法是组织培养，恙虫病东方体能在多种原代细胞和传代细胞发育良好。常用的细胞有地鼠肾细胞，睾丸细胞，猴、家兔、大白鼠等睾丸细胞、鸡胚细胞等原代细胞和羊膜，HeLa,L细胞、Vero-E6、BSC-1、BSC-10等传代细胞。山本正悟等（1988）比较了环磷酰胺处理小白鼠的分离法与组织细胞培养法分离弱毒株的结果，环磷酰胺处理小白鼠分离法的阳性率为91～100％BSC-40的阳性率为90％-100％，L细胞的阳性率为35～82％。现有资料说明：从自然界各种材料分离弱毒株，这两种方法如能结合进行，可获得更佳的效果。有一份材料接种小白鼠未获成功，而用L细胞培养则检出恙虫病东方体。

　　3.2　恙虫病检测新技术　恙虫病实验诊断技术长期以来，主要使用血清学和免疫学方法，其敏感性和特异性均受到一定限制。近年来把PCR技术和核酸探针技术引进恙虫病的检测和研究中，提高了恙虫病的诊断水平，并解决了过去难以解决的问题。

　　3.2.1　陈添胜等^［18］在我国首先应用Stoven（1990）发表的恙虫病东方体58kDa抗原基因序列，设计一对扩增产物为987bp的引物，用于PCR扩增的基因克隆，所建立的方法在该实验室进一步应用于恙虫病患者和鼠、恙螨的检测和研究。黎家灿等根据恙虫病东方体表面蛋白58kDa基因序列设计合成的PCR法与免疫荧光法、免疫金银染色法进行比较，检测恙螨体内东方体，PCR法阳性率达到90％以上，后两种方法阳性率仅为41.2％^［19］。严延生等参照(Murai(1992)从581kDa抗原基因序列设计的引物，进行套氏PCR扩增，应用于急性期恙虫病患者标本的检测，在10份标本中，除已用氯霉素治疗的1例外，PCR扩增产物均检出88bp的DNA片段，同时用免疫荧光法检测，只有5例阳性，在2个月后复查时又查出3例阳性，说明PCR阳性出现早于免疫荧光，也证明PCR技术是十分敏感和特异^［20］。郭恒彬等参照Furuya(1991)从恙虫病东方体56kDa抗原基因序列设计的引物，也采用套氏PCR技术检测8例恙虫病典型患者血液，均可扩增出481-507bp的恙虫病东方体DNA片段，这8例患者用免疫荧光法检出7例阳性^［21］。

　　3.2.2　PCR技术用于恙螨的检测　严延生等使用终产物为88bp的套氏PCR技术，检测单个地里纤恙螨的阳性率为13.7％^［20］。郭恒彬等（1996）将单个恙螨幼虫磨碎后，再经SDS裂解方式，提取DNA模板，用设计终产物为481～507bp的套氏PCR扩增，检测61只小板纤恙螨幼虫的恙虫病东方体阳性率为3.22％^［27］，低于前述地里纤恙螨的阳性率。

　　应用PCR技术研究地里纤恙螨体内恙虫病东方体DNA的动态变化，证明东方体幼虫→若虫→成虫→卵传递给下一代，并证明东方体在成虫体可持续存在270～360天^［23］。

　　3.2.3　PCR技术用于抗原分型　恙虫病东方体抗原型，从来都用补体结合试验和免疫荧光试验鉴定，各型间交叉反应广泛。吉田等（1994）用套氏PCR鉴定恙虫病东方体的抗原型别。郭恒彬等（1997）^［24］报道了PCR技术的鉴定型别结果，以恙虫病东方体外膜主要蛋白56kDa特异抗原基因编码区的群、型特异引物，分别对（Gilliam、Karp、Kato、Kawasaki和Kuroki5型标准株进行PCR检测和分型。结果证明所构建的群特异引物，具有东方体的特异性；型特异引物具有型特异性，型与型之间无交叉反应，并首次证明我国江苏存在着Kawasaki型恙虫病东方体。张海红等（1991）参照Furuya设计的恙虫病东方体Sta56kDa群、型特异引物，其群特异引物扩增后产物为481～507bp多核苷酸。Karp、Gilliam、Kato、Kawasaki和Kuroki型特异引物扩增后产物，分别为230、407、242、523和220bp。进行套氏PCR鉴定广东佛山和海南等地区17份阳性患者和鼠类的恙虫病东方体，结果均与Karp型特异引物扩增后有230bp的扩增带，而与其型特异引物扩增后无DNA扩增带，表明该地区有Karp型恙虫病东方体流行^［25］。

　　3.2.4　探针技术　是在核酸杂交基础上发展起来的一种用于研究和诊断的新技术。奚志勇和黎家灿根据恙虫病东方体的型特异的56基因序列合成一对引物Sta58和Sta56应用PCR扩增恙虫病东方体DNA大量制备地高辛Sta56基因探针，以及引物末端转移酶标记探针，证明这2种探针（1）通过恙虫病东方体3个标准株的检测，能扩增出条带，而不能使普氏、莫氏和立氏次体扩增出条带。（2）Sta58和Sta56引物以Karp株DNA7个系列稀释度进行PCR扩增，能出现目的条带的最大稀释度均为1∶10⁵。可见这两种探针具有高度的特异性和敏感性^［26］。

　　3.2.5　限制性片段多态性分析（RFLP）　在1992年首先应用RFLP技术，将恙虫病东方体分成不同亚型^［5］。我国郭恒彬等（1997）以恙虫病东方体型特异抗原56kDa基因序列为靶DNA，构建群、型引物，用PCR进行检测分型，用群引物扩增产物进行RFLP分析，恙虫病东方体5型标准株和5株江苏地方株，经3种酶切割后。5个地方株片段DNA，无Hhe I酶切点；碱基序列测定结果与Kawasaki型相应DNA片段的碱基序列同源性为96.37％，而与其他恙虫病东方体同源性均少于52％，这表明江苏株属于Kawasaki型，但又有遗传差异^［15］。

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