鼠坐骨神经再生早期轴浆流改变的实验研究

中华手外科杂志 1998年第4期第14卷 基础研究

作者：徐文东　邓守真　徐建光　顾玉东　唐峰　沈丽英

单位：徐文东　徐建光　顾玉东　沈丽英　200040　上海医科大学华山医院手外科；邓守贞　唐峰　核医学科

　　关键词： 周围神经；轴浆流；放射性核素显像；动物；实验

　　 【摘要】　目的　 探索同位素示踪早期检测神经再生的可行性,并与神经电图-肌电图检测结果进行比较，为临床应用奠定基础。方法　将鼠坐骨神经切断并作神经缝合,术后1、2、3、4周用微量注射器将¹²⁵I-酪氨酸直接注射入大鼠坐骨神经干内,于注射后8、12、16小时取样以γ-计数器检测其放射性。测定再生神经¹²⁵I-酪氨酸转运规律,并与神经电图-肌电图检测结果、光镜下再生髓鞘形态学变化相比较。结果　术后2周轴浆流即可通过缝合口,早于神经电图-肌电图出现时间;与再生髓鞘出现时间相符。结论　应用轴浆流同位素示踪法早期检测神经再生,较神经电图-肌电图具有明显的优越性。

　　The changes of axoplasm at the early stage of regeneration in rat sciatic nerve: an experimental study　XU Wendong, DENG Shouzhen, XU Jianguang, et al. Department of Hand Surgery, Huashan hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200040

　　【Abstract】　Objective　To test the possibility of evaluating early nerve regeneration by in vivo detection of the radioiodined-axoplasm, and compare this method with the electromyography examination.Methods　1, 2, 3, 4 weeks after nerve coaptation, ¹²⁵I-Tyrosine was injected into the sciatic nerve trunk by a microsyringe. The radioactivity of each sample was detected in a γ-counter in different interval,i.e. 8,12,16 hours after injection. The transportation character was determined and compared with the electromyographic investigation and the morphologic changes.Results　The regenerating radioiodined-axoplasm can be detected distal to the coaptation site 2 weeks after suturing. Radionuclide detection was earlier than the electromyography findings, and in accordance with the time when regenerating myelin sheath appears.Conclusions　To evaluate nerve regeneration on early stage after nerve coaptation in vivo detection of radioiodined-axoplasm is superior to electromyographic investigation.

　　【Key Words】　Peripheral nerve　　Axoplasmic flow　　Radionuclide imaging　　Animal,Laboratory

　　周围神经损伤修复后,临床上如何能早期（1～3个月内）对神经再生的质量作出精确的判断,一直是周围神经外科领域中的一大难题。目前,已有研究表明,轴浆流转运是反映神经病理生理状况的一个直接指标,而神经再生时轴浆流通过缝合口是再生的最初证据^［1,2］。当今,同位素检测设备已日趋完善,用轴浆流同位素示踪在体检测,达到早期反映周围神经再生的质量已成为可能,如获成功则对周围神经损伤后的诊治能起到很大的推动作用。根据这一设想,我们设计了本实验,以探索同位素示踪早期检测神经再生的可行性,并与神经电图-肌电图的检测结果进行比较,为逐步过渡到临床应用进行系列的基础研究。

　　材料与方法

　　一、¹²⁵I-酪氨酸的制备

　　酪氨酸的放射性碘标记采用改良氯胺T法^［3］，在室温下进行。画出洗脱曲线，将碘标峰上放射性活度最高的试剂作为实验试剂。

　　二、坐骨神经再生早期轴浆流转运的研究

　　选用SD大鼠(250～350 g)48只,雌雄不拘,分成4组,每组12只。用1%硫喷妥钠（25 mg/kg)腹腔内注射麻醉。暴露双侧坐骨神经。左侧为实验侧,右侧为正常对照侧。实验侧在坐骨神经出梨状肌后约10mm处用眼科剪刀剪断,于手术显微镜下用12-0无创尼龙针线行神经外膜缝合,共6针。伤口内置长效青霉素粉剂后依次缝合肌肉、皮肤。正常对照侧则不切断坐骨神经。

　　术后饲养于清洁级动物房内。各组大鼠分别于术后1、2、3、4周进行¹²⁵I-酪氨酸神经干内注射。麻醉及暴露法同前。在神经缝合口上4mm处,将15 μl的微量注射器斜向插入坐骨神经干内,缓慢注入20 μl的¹²⁵I-酪氨酸,时间约为20分钟。对照侧用同法在神经鞘膜下注射酪氨酸溶液20μl。各组再分成3组,每组4只,分别于注射后8、12，16小时处死。自缝合口上方4mm,向下至标志点下15mm处切取坐骨神经段。将标本在生理盐水中漂洗1分钟,剪除鞘膜外结缔组织,分离神经纤维和神经鞘膜,每间隔2mm切取一段神经纤维,分装于不同试管,用γ-放免计数器(FJ-2003/50型)测量各管内的放射性计数,以转运距离为横坐标,放射性计数为纵坐标绘制不同时间段各神经纤维轴浆流转运曲线^［3］。

　　三、再生坐骨神经的神经电图-肌电图检测

　　各组大鼠在处死前分别检测腓肠肌静止时的肌电图(EMG),坐骨神经传导速度(MNCV)和体感诱发电位(SEP)。在大鼠股内侧分离股二头肌,将其向外侧掀起,充分暴露腓肠肌。检测肌电图时,用同芯针电极置于腓肠肌内记录其肌电位。检测MNCV时,刺激电极分别置于神经缝合口远近端,间隔0.5cm,记录电极置于腓肠肌。检测SEP时,刺激电极同样分别置于缝合口远近端,间隔0.5cm,头皮记录电极按国际脑电图置于枕部下肢投射区。

　　四、组织形态学检测

　　切取的神经纤维标本在完成放射性检测后立即用10%福马林液固定。常规石蜡包埋切片,每个标本横向切取 3个切片,Fast-Blue染色,在光镜下观察、并在TJTY图像分析仪下测定再生髓鞘的直径和厚度。

　　结　　果

　　一、再生神经轴浆流转运曲线

　　对不同时间的轴浆流转运曲线进行分析后发现:(1)术后1周,¹²⁵I-酪氨酸都聚集在缝合口近端,在缝合口远端未发现¹²⁵I-酪氨酸。（2）术后2周,缝合口远端已发现¹²⁵I-酪氨酸,并随术后时间的延长向远端移动,但峰值小,转运速率慢。（3）术后3周,¹²⁵I-酪氨酸在缝合口远端的转运已较明显,但峰值和转运速率仍稍小于正常神经内¹²⁵I-酪氨酸的转运。此时的转运速率约14mm/日。（4）术后4周,¹²⁵I-酪氨酸通过缝合口向远端的转运已恢复到正常神经转运水平,转运速率已加快到20mm/日。

　　二、神经电图-肌电图检测结果（表1）

表1　术后不同时间组实验侧及正常侧的肌电图、运动神经传导速度和体感诱发电位^*（±s）

* 各实验侧鼠数=10只。 正常侧为各组正常对照神经检测后统一统计的结果，鼠数=48前，

　　从各组再生神经的神经电图-肌电图检测结果中发现:术后1～3周,腓肠肌静止时的EMG表现为正尖波,并不能诱发出MNCV。术后第4周,EMG出现单纯相,并能诱发出MNCV,但MNCV的潜伏期和波幅都较正常对照侧有明显的改变,潜伏期延长,波幅降低（P＜0.05）。术后1周时,实验侧的SEP已能测出,但其潜伏期较正常对照侧慢,波幅较低;术后2周,各实验组的SEP都可检测出,其波幅和潜伏期与正常对照侧相比无明显差异（P＞0.05）。

　　三、光镜下形态学观察及图像分析结果

　　术后第1周,缝合口远端为大量崩解的髓鞘,表现为髓鞘外形发生扭曲,出现髓鞘碎片,无新生髓鞘发现。术后2周,髓鞘崩解进一步发展,已难见到完整的髓鞘,髓鞘碎片被吸收。有新生髓鞘出现,表现为壁薄、直径较正常髓鞘小,髓鞘厚度和直径分别为正常对照侧的48.5％和51.3%。术后3周,新生髓鞘进一步增多,髓鞘厚度和直径分别为正常对照侧的70.6%和74.8%。术后4周,视野中已可见大量新生的髓鞘,髓鞘厚度和直径分别为正常对照侧的81.2%和85.2%。

　　讨　　论

　　周围神经损伤后的修复一直是周围神经外科中的一个难题,目前在临床上还有很大一部分病例修复后效果不佳。虽然神经再生的质量与神经损伤的性质、程度、手术修复时机、修复得精确与否等多种因素有关,但能否在术后早期即对神经再生质量做出精确的判断,是影响神经修复最终效果的一个重要因素。目前,在神经修复术后判断神经修复质量的方法主要是通过肌电图和临床Tinel征检查,但往往需要6个月或更长时间才能进行有效的判断。至今为止,尚无一种早期的、客观的、无创或微创的直接检测方法能进行早期判断,只能进行长时间的临床观察。神经再生只有3～6个月的“黄金时间”,因此,临床上常错失神经再修复以及神经再生的“黄金时间”。所以,如能创立一种对再生神经早期、直观的检测方法,在神经修复后能早期发现神经再生质量不佳时,即可立即手术探查;避免了长期观察,并可缩短肌肉失神经支配的时限。这是周围神经外科中亟待解决的一个难题^［4］。

　　对神经内轴浆流转运的研究,早在本世纪60、70年代即已开始,现今对于轴浆流的绝大多数认识是从同位素研究中得到的。同位素标记物质随轴浆流转运的速率和转运量往往被用来直接反映神经的病理生理状况,神经再生的最初证据就是轴浆流通过缝合口。目前对轴浆流的研究已进入分子水平和对转运机制的研究。但利用轴浆流作为检测对象,用同位素示踪法在体检测轴浆流转运,并以此反映神经的功能状态,国内外尚未见报道。实际上,随着同位素标记技术的提高和同位素检测设备的改善,对微量放射性已能检测,进行同位素标记物质随轴浆流转运的体内检测也已有可能;并有可能成为临床上检测神经再生的重要手段。以往,对轴浆流的研究多偏重于基础研究,多采用放射自显影方法,因测量技术复杂而不易推广。其标记方法、注入途径及放射线特性均难以适应临床应用的要求,无法过渡到人体体外检测^［5,6］。本实验的目的,旨在在原有的研究基础上,探索同位素示踪早期在体检测神经再生的可行性,并与神经电图-肌电图测定结果相比较,以判断其可靠性。

　　对再生神经轴浆转运的研究结果表明,神经缝合后1周,缝合口远端无放射性发现,而在缝合口近端有较强的放射性发现,说明此时再生轴突尚未通过缝合口,注入并被神经吸收的¹²⁵I-酪氨酸都聚集在缝合口近端。神经缝合后2周,缝合口远端即发现有放射性,说明再生轴突自术后2周开始即具有轴浆流转运的能力。由于神经干内¹²⁵I-酪氨酸注入的模型对放射性前体被神经摄取不能进行定量估测,我们无法对正常神经和再生神经轴浆流转运进行定量比较。对2周以后再生神经在不同时间段¹²⁵I-酪氨酸转运距离测定的结果表明,再生神经的轴浆流转运初期是不规律的,表现为转运速率慢、非匀速。术后3周,则表现得较为规律,但转运速率仍较正常转运速率慢,基本表现为转运速率随转运时间而下降。术后4周,轴浆流转运速率已基本恢复到正常水平。各神经标本的放射性强度与新生髓鞘在光镜下的表现有相关性,即新生髓鞘多、直径大、鞘壁厚的标本中放射性强度也较大。但轴浆流转运速率的恢复要优先于髓鞘厚度和直径的生长,在术后4周,轴浆流转运速率已恢复到正常水平时,髓鞘的厚度和直径仍为正常神经的80％左右。

　　对再生神经的神经电图-肌电图检测结果表明:术后第1～3周,EMG出现正尖波,但不能测出MNCV,说明失神经支配的肌纤维和运动终板后膜对血液中乙酰胆碱敏感性增高,肌肉松弛时出现自发失神经电位。术后第4周,肌肉静止时EMG出现新生电位,并可测出MNCV,但潜伏期和波幅都较正常对照组有明显的降低。说明在术后4周检测EMG和MNCV才能反映出神经再生情况。在术后各时间组SEP都有出现,且各组检测结果与正常对照侧的潜伏期和波幅无显著性差异。由此证实,SEP检测结果和轴浆流转运及髓鞘染色无明显相关性。在大鼠坐骨神经模型上进行SEP检测,国内外尚未见相关报道,由于再生神经的电生理改变和轴浆流转运之间的关系尚未完全阐明,故对本研究中SEP的检测结果尚无法进行完全合理的解释。可能的原因是:极少数新生的神经纤维在术后1周已通过缝合口,并具有了传递电兴奋的能力。当然,由于SEP检测时对动物的麻醉深度掌握要求极高,不能完全排除超强刺激时其它肌肉的容积传导造成的误差。

　　本研究结果初步证实,早期检测神经再生的方法中,轴浆流同位素示踪法和神经电图-肌电图相比较,前者具有早期、可靠的优点。它在术后2周即可检测出神经再生,而EMG和MNCV则要到术后4周才可反映出神经再生。SEP的检测结果,由于其干扰因素多,方法不稳定,早期检测神经再生较困难。综上所述,轴浆流同位素示踪是反映神经再生的良好早期指标。在目前同位素检测手段发展迅速,已可对微量放射性进行检测的基础上,在体进行轴浆流的同位素示踪检测,早期检测神经再生的质量已有可能成为现实，虽然尚须经过很长时间的动物实验和进行长期的探索。但如果一旦在人体应用此检测手段,这将是周围神经外科领域中的一大突破,必能在很大程度上提高周围神经损伤后的诊治疗效。

　　本课题为上海市医学领先学科基金、国家自然科学基金和美国中华医学基金资助项目

　　参考文献

　　［1］甘思德.再生神经的轴浆转运与轴突构筑的重建.复旦大学神经生物学讲座,1988,4:91-93.

　　［2］甘思德.神经再生:问题和瞻望.生理科学进展,1994,25(4):295-298.

　　［3］徐文东,徐建光,顾玉东,等.¹²⁵I-酪氨酸在大鼠坐骨神经内转运的初步研究.中华手外科杂志,1997,13:44-46.

　　［4］顾玉东.臂丛神经损伤与疾病的诊治.上海:上海医科大学出版社,1992.326-329.

　　［5］Lundborg G. Nerve regeneration and repair. Acta Orthop Scand,1987,58:145-148.

　　［6］Mackinnon SE. Surgery of the peripheral nerve. New York: Thieme,1988.11-28.

(收稿：1998-04-10）