人鼻粘膜上皮细胞Na⁺通道的初步研究

　　中华耳鼻咽喉科杂志1999年第34卷第5期

张欣欣　郭永清　董震　杨占泉　张文杰

　　摘要　目的：明确人鼻粘膜上皮细胞Na⁺通道的特性，为研究Na⁺通道在鼻粘膜病理性改变及治疗中的作用奠定理论基础。方法：利用膜片钳技术对经无血清气-液界面培养的鼻源性鼾症患者手术切除下鼻甲标本的鼻上皮细胞进行Na⁺通道基本特性研究。结果：在细胞贴附式膜片上，可记录到典型的单通道电流，其电导为21.09　pS，反转电位为-50.96　mV，且77.78%反转电位＜-40　mV，离子通透性比率P_Na/P_K＞5.80。在Na⁺通道抑制剂10^-4　mmol/L Amiloride存在于电极液内时，Na⁺通道发生率从26.7%减少到5.13%（P＜0.05），表明大部分Na⁺通道可被Amiloride抑制。10^-3　mmol/L Ca²⁺存在于浴夜时,Na⁺通道的发生率无明显增加（P＞0.05），而电压对开放概率无明显影响。结论：在细胞贴附式膜片上，人鼻粘膜上皮细胞具有Amiloride敏感型及Amiloride非敏感型的Na⁺通道，且大部分是Na⁺选择性通道，细胞外液的Ca²⁺不能激活Na⁺通道的开放，通道的开放概率是非电压依赖性的。

　　关键词：钠通道　膜片箱术　鼻粘膜　上皮细胞

　　　Na⁺通道是贯穿于细胞膜两侧的大分子物质，在脂质双层膜上构成具有高度选择性的亲水孔道，其启闭直接影响细胞膜两侧Na⁺的浓度。我们利用膜片钳技术，对鼻源性鼾症患者手术切除下鼻甲标本进行鼻粘膜上皮无血清气-液界面培养细胞的基本特性进行研究，以了解鼻粘膜上皮Na⁺通道在基本正常情况下的一些电生理特性。

　　 材料及方法

　　1.人鼻粘膜上皮细胞无血清气-液界面原代培养：取我科鼻源性鼾症患者手术切除的下鼻甲标本8例，男6例，女2例，年龄30～46岁，平均40.3岁。按参考文献［1］进行细胞培养。

　　2．膜片钳技术：细胞培养7天后，在室温下（26～29°C），应用膜片钳放大器(日本NIHONKOHDEN 公司6.0 CEZ-2300 )及Pclamp软件（美国Axon Instrument.INC公司6.01 Pclamp)进行研究。玻璃电极对融和的单层细胞或亚融和的单层细胞进行回吸，产生高阻封接，封接电阻为5～30 GΩ。数字化采样频率1 kHz，保持电位-40 mV，阶跃时间2 s。

　　3.数据处理：测定开放概率，在每个通道开放10～60 s形成比较稳定和具有代表性的电流曲线后，测出开放总时间/采样时间。电流-电压关系曲线表示每个钳制电压与电流的关系。

　　4.溶液和试剂：本研究所用的溶液组成如表1所示，所有细胞培养试剂及Na⁺通道阻断剂Amiloride均购于美国Sigma公司。

表1　溶液的组成(mmol/L)

　　 TES: N-3（羟基）甲基-2-氨乙烷磺酸［N-Tris(Hydroxy)methyl-2-amino-ethanesulfonie］ 　　5.统计学处理:采用t检验，通道发生率采用χ²检验。

　　结果

　　一、Na⁺通道的确定

　　研究证明，正常NaCl溶液在浴液和电极液时，反转电位 ＜-40 mV为Na⁺选择性通道(Na⁺易于通透的通道)，反转电位在-10～-40 mV为非选择性阳离子通道(Na⁺和其它阳离子均易通透的通道)。由于本研究对象为可通透Na⁺的全部通道，故测定反转电位＜-10 mV的所有通道。为确定反转电位＜-10mV通道确实是Na⁺通道，在电极液内用氯化胆碱（胆碱为非渗透离子）代替NaCl,在这种情况下，未发现有反转电位＜-10 mV的通道，表明反转电位＜-10 mV的通道确实是Na⁺通道。

　　二、Na⁺通道的特性

　　1．Na⁺通道启闭动力学：图1为在不同电极电压下所见到的典型的单通道电流，Pclamp软件计算通道的平均开放时间为(9.03±2.11) ms，平均关闭时间为(19.12±1.95) ms。

图1　细胞贴附式膜片上，在不同的电极电压下，Na⁺通道的单通道记录。电极液及浴液均为正常NaCl溶液(含1 mol/L Ca²⁺)

　　2．Na⁺通道的选择性及其电导：图2为Na⁺通道电流-电压关系曲线，在有限的电压范围内，Na⁺通道为非整和性的，电导为(21.09±2.13)pS,反转电位为(-50.16±4.63) mV（n=18），其中22.22%（n=4）通道的反转电位在-10～-40 mV之间，77.78%（n=14）反转电位＜-40 mV。根据选择通透性公式，通透比率P_Na/P_K＞5.80，表明大部分通道对Na⁺的选择明显超过K⁺（正常NaCl在浴液时，K⁺的反转电位为+60 mV）。为进一步证实通道对Na⁺的高选择性，电极液用富含KCl容液替代NaCl容液，反转电位明显减小(-34.25±3.56) mV,与前者相比差异有显著性（P＜0.001），表明大部分通道确实对Na⁺具有较高的选择性。

图2　在细胞贴附式膜片上，人鼻粘膜上皮细胞Na⁺通道电流-电压曲线，浴液均为正常NaCl溶液

　　3．开放概率与电压的关系：如图3所示，Na⁺通道的开放概率与电压之间为非线性关系。由此可见，Na⁺通道的开放概率是非电压依赖性的。

图3　细胞贴附式膜片上，人鼻粘膜上皮细胞有代表性的6个Na⁺通道开放概率与电压的关系。电极液及浴液均为NaCl溶液

　　 4．Amiloride对Na⁺通道的影响：在10^-4 mmol/L Amiloride存在于电极液时，Na⁺通道发生率从26.67%（8/30）减少到5.13%（2/39）（P＜0.05）,而10^-5～10^-7mmol/L Amiloride对Na⁺通道发生率无影响（P＞0.05）。

　　5.Ca²⁺对Na⁺通道的影响:当浴液中Ca²⁺ 浓度从10^-3 mmol/L减少到10^-7mmol/L时，Na⁺通道发生率从26.67%（8/30）减少到19.44%（7/36）（P＞0.05）。表明Na⁺通道发生率与细胞外液的Ca²⁺浓度无关。

　　 讨论

　　电生理及同位素标记离子流量研究均证实呼吸道上皮细胞是Na⁺回吸收上皮，跨膜的Na⁺活动同Koefoed-Johnson-Ussing模型电发生性Na⁺回吸收是一致的^［2,3］。分子生物学研究也证实在培养的人呼吸道上皮细胞上可检测到Na⁺通道α亚型mRNA的表达^［4］。国外学者应用膜片钳技术已记录到了不同亚型Na⁺通道^［4，5］。我们利用气-液界面培养的人鼻粘膜上皮细胞进行Na⁺通道测量，这种细胞培养方法模拟正常人体上皮细胞的生长特点，为培养的细胞创造一个生长极性，细胞间形成紧密连接，细胞表面生长微绒毛及纤毛^［1］（该结果我们已用电镜证实，文章另发表）。此外，为使细胞处于生理状态的完整性，采用细胞贴附式膜片钳方法对Na⁺通道的门控动力学、电导及对离子选择性等一些特性进行研究。研究结果显示：在培养的人鼻粘膜上皮细胞的顶端膜（apical membrane）上，可记录到典型的单通道电流，其电导为21.09 pS,不同于Palmer测得的肾集合管上皮细胞5 pS低电导的Na⁺通道^［6］，通道的平均开放和关闭时间分别是(9.03±2.11) ms和(19.12±1.95) ms。对通道的门控研究发现，在Na⁺通道抑制剂10^-4mmol/L Amiloride存在于电极液内时，Na⁺通道发生率从26.67%减少到5.13%，表明大部分Na⁺通道可被Amiloride抑制，是Amiloride敏感型的Na⁺通道，只有少部分对Amiloride不敏感，这同Chinet对鼻上皮细胞的研究结果相一致^［5］。Na⁺通道对细胞外液的Ca²⁺浓度无反应,在10^-3mmol/L Ca²⁺存在于浴液时，Na⁺通道发生率无明显增大。已有研究表明，细胞内液的Ca²⁺可作为第二信使，通过激活钙依赖性蛋白激酶启动离子通道的开放^［7］,在细胞切除式膜片钳上，通过改变细胞内液Ca²⁺的浓度，培养的鼻上皮细胞可记录到Ca²⁺敏感的Na⁺通道^［5］。本研究在细胞贴附式膜片钳上，没有发现Ca²⁺敏感的Na⁺通道，这表明细胞外液的Ca²⁺不能激活Na⁺通道，似乎也说明鼻上皮细胞缺乏Ca²⁺通道，因而，细胞外液的Ca²⁺很难进入细胞内发挥其第二信使的作用。此外，与许多可兴奋细胞（如神经细胞）不同的是，在细胞贴附式膜片钳上，鼻上皮细胞这种非兴奋性细胞Na⁺通道的门控，是非电压依赖性的，它的开放概率与电压的高低无关。关于通道对离子选择性，电生理研究表明：可通过测量反转电位计算通透比率来确定离子的选择性，由于鼻上皮细胞的顶端膜主要通透二种等价阳离子，即Na⁺和K⁺，因此，通道对Na⁺的选择性是相对于K⁺而言的，对于Na⁺，反转电位越负，对Na⁺的选择性越高^［5］。本研究结果表明大部分通道对Na⁺有较高的选择性,是Na⁺选择性通道，少部分是非选择性阳离子通道。另外，我们发现，反转电位＜-40 mV的所有通道的平均值是(-52.05±3.56) mV，这同Willumsen用宏观电生理测定的Na⁺跨膜电化学驱动力的值（-51mV）近似（理论证明它的绝对值与Na⁺反转电位相似）^［8］。也表明了本研究的可靠性。

　　鼻粘膜上皮细胞Na⁺通道的这些特性对研究它在鼻粘膜病理状态下（如鼻炎鼻窦炎和鼻息肉的形成）的作用及治疗均有重要的意义，特别在研制开发新的治疗药物方面具有广阔前景。

　　 作者单位：130031长春 白求恩医科大学第三临床医学院耳鼻咽喉-头颈外科

　　 参考文献

　　1　Yamaya M,Finkbeiner WE,Chun SY,et al. Differentiated structure and function of cultures from human tracheal epithelium.Am J Physiol,1992,262:L713-724.

　　2　Boucher RC,Cotton CU,Gatzy JT,et al. Evidence for reduced Cl^? and increased Na⁺ permeablility in cystic fibrosis human primary cell culture.J Physiol Lond,1988,405:77-103.

　　3　Boucher RC,Stutts MJ,Knowle MR,et al. Na⁺ transport in cystic fibrosisrespiratory epithelia:Abnormal basal rate and response to aderylate cyclase activation. J Clin Invest, 1986, 78:1245-1252.

　　4　Kunzelmann K,Kathofer S,Hipper A,et al.Culture-dependent expression of Na⁺　conductance in airway epithelial cells.Pflugers,1996,431:578-586.

　　5　Chiinet TC,Fullton JM,Yankaskas JR,et al.Sodium-permeable channels in the apical membrane of human nasal epithelial cells.Am J Physiol,1993,265:C1050-1060.

　　6　Palmer LG,Frindt G .Epithelial sodium channels characterization by using the patch clamp technique. Fed Proc,1986,45:2708-2716.

　　7　Wagner JA,Conzens AL,Schulman H,et al. Activation of chloride channels in normal and cystic fibrosis airway epithelial cells by multifunction/calmodulin- dependent protein kinase. Nature,1991,28:793-796.

　　8　Willumsen NJ,Boucher RC.Sodium transport and intracellular sodium activity in cultured human nasal epithelium.Am J Physiol,1991，261:C319～331.